大豆异黄酮合成途径基因的进化分析及转录因子GmMYB184的功能鉴定

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中文摘要：异黄酮是苯丙烷代谢途径产生的次生代谢产物，主要存在于豆科植物中。异黄酮类次生代谢产物对于植物与微生物的互作非常重要，并且有着重要的医疗保健作用，因此提高异黄酮含量是大豆品质育种的目标之一。但是大豆异黄酮的合成代谢途径非常复杂，对单个途径酶进行修饰的方法难以取得理想效果。蛋白互作的研究加深了我们对大豆异黄酮合成的分子机制的了解，对于转录因子的研究能够促进大豆异黄酮或者其他农艺性状的改良，对大豆品质的遗传工程有所帮助。异黄酮的合成起始于苯丙烷代谢的公共途径，从苯丙氨酸开始，由一系列含有多个拷贝的酶催化，由分支节点酶导入异黄酮合成的分支途径，最终形成异黄酮及异黄酮类衍生物。尽管苯丙烷代谢途径包括其分支异黄酮代谢途径是目前研究得比较透彻的次生代谢途径，但是关于异黄酮代谢途径基因的分子进化仍然所知甚少，因此，研究关键基因的进化模式，结合“metabolons”理论的途径酶互作分析，有助于更透彻地了解异黄酮代谢途径复杂的调控网络。此外，鉴定一些调控途径关键酶的转录因子可以进一步了解异黄酮合成调控的分子机制，为代谢工程和遗传改良奠定理论基础。本研究通过对异黄酮代谢途径基因进行进化模式的分析，发现关键基因经历了相似的选择模式，并表现出趋同进化，推测这些酶可能形成大分子蛋白复合物。用酵母双杂的方法对途径一部分酶的拷贝组合进行了互作分析，实验结果表明IFS能够与分支节点酶CHS、CHR互作，CHI能够与CHS、CHR互作，PAL能够与C4H互作。这些结果一定程度证明了这样的大分子蛋白复合物存在的可能性。此外，本研究克隆了一个大豆非生物胁迫响应相关转录因子GmMYB184并进行了初步的功能验证。亚细胞定位研究证实了GmMYB184转录因子的细胞核定位。组织表达分析表明了该转录因子基因与IFS2的表达模式相同，在根和成熟种子中大量表达，并且随着种子发育，表达量上升。同时，GmMYB184和IFS2的表达模式与异黄酮的积累模式相似。谷胱甘肽诱导表达分析表明该转录因子基因与IFS2共诱导，可能参与相似的生物过程。采用双荧光素酶报告系统分析其对异黄酮合成途径关键基因的转录激活活性影响，发现GmMYB184能够分别促进CHS8和IFS2启动子表达活性提高5倍和7倍。最后通过发根农杆菌介导的转化系统，找到该转录因子在异黄酮合成调控中的直接作用证据。沉默GmMYB184导致异黄酮含量的显著下降，表明GmMYB184转录因子对于异黄酮的合成过程是必须的。但是，过表达GmMYB184不足以显著提高毛状根中异黄酮的含量。总之，本研究从进化选择、蛋白互作和转录调控等层面研究了大豆异黄酮生物合成途径，为大豆异黄酮合成的分子机制及大豆异黄酮相关品质改良提供了理论依据。

作者：

朱莹

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关键词：

大豆遗传育种异黄酮分子进化蛋白互作转录因子

授予学位：

硕士

学科专业：

作物遗传育种

导师：

喻德跃

学位年度：

2016

学位授予单位：

南京农业大学

语种：

中文

中图分类号：