摘要
JNK信号通路对调控机体内各种应激应答反应具有重要意义，而关于热应激激活的JNK信号通路所调控的细胞凋亡过程一直备受争论。本试验通过JNK特异性抑制剂SP600125作用于热处理后体外培养的奶牛乳腺上皮细胞进行研究，测定其对乳腺细胞活力、凋亡、氧化损伤及相关基因与蛋白表达方面的影响，从细胞水平探讨JNK信号通路与热应激下奶牛乳腺上皮细胞凋亡的相关作用。本试验分为三个部分: 1、JNK抑制剂对热处理下奶牛乳腺上皮细胞活力及凋亡的影响。 用含不同浓度(0、20、40、60μmol/L) SP600125的DMEM培养基处理细胞30min后，37℃组（正常处理组）在37℃培养箱孵育30min，41℃组（热处理组）在41℃培养箱孵育30min，恢复6h。采用MTT法测定热处理对体外培养的奶牛乳腺上皮细胞活力的影响，通过AnnexinⅤ-FITC双染法、利用流式细胞仪测定细胞的凋亡率。结果表明，与37℃组相比，41℃组细胞活力均明显降低，细胞凋亡率均明显升高;在41℃处理下，当添加20μmol/L抑制剂时，细胞活力显著高于未添加组(P＜0.05)，添加40μmol/L组细胞活力与20μμmol/L组非常接近，而添加60μmol/L抑制剂细胞活力最低;在41℃处理下，与0μmol/L组相比，各组细胞凋亡率分别下降了37％、30％和27％(P＜0.01)，而20μmol/L的抑制剂处理细胞凋亡最少。从细胞活力及凋亡的检测结果，说明41℃0.5h热处理使细胞产生了热应激、诱导了细胞凋亡，为进一步精确探讨JNK抑制剂对热处理下乳腺上皮细胞凋亡的影响，本试验将采用20和40μmol/L两个浓度梯度进行后续试验研究。 2、JNK抑制剂对热处理下奶牛乳腺上皮细胞的氧化损伤影响。 用含不同浓度(0、20、40μmol/L) SP600125的DMEM培养基处理细胞30min后，37℃组（正常处理组）在37℃培养箱孵育30min，41℃组（热处理组）在41℃培养箱孵育30min，恢复6h。测定细胞中SOD的活性、GSH的含量和MDA的含量，测定细胞中ROS的表达水平，测定HSP72mRNA及蛋白的表达。结果表明，与37℃组相比，41℃组SOD活性和GSH含量显著降低，ROS水平和MDA含量显著升高，HSP72的表达显著升高;在41℃处理下，当添加20μmol/L抑制剂时，ROS水平(P＜0.01)和MDA含量(P＜0.05)显著低于未添加组，而SOD活性(P＜0.01)和GSH含量(P＜0.05)显著高于未添加组，HSP72的mRNA表达量比0μmol/L组升高了21.9％(P＜0.01)，HSP72蛋白表达水平比0μmol/L组升高了54.4％(P＜0.05)。结论:热处理使细胞受到氧化应激，HSP72的上调对细胞起到保护性作用，抑制JNK可以缓解细胞氧化应激损伤。 3、JNK信号通路对热处理下奶牛乳腺上皮细胞凋亡的相关基因和蛋白表达的影响。 试验处理同试验二。测定Bax、Bcl-2、p-JNK及JNK信号通路下游基因P53、PUMA基因及蛋白的表达。结果表明，与37℃组相比，41℃组p-JNK、JNK、Bax/Bcl-2、P53、PUMA的表达量显著升高;在41℃处理下，当添加20μmol/L抑制剂时，JNK的mRNA表达量显著低于未添加组(P＜0.01)，Bax/Bcl-2的mRNA表达量比0μmol/L组显著下调了14.7％(P＜0.01);P53和PUMA的mRNA表达量比未添加组分别下调了15.6％(P＜0.01)和13.4％(P＜0.01);p-JNK的蛋白表达量比0μmol/L组显著降低了36.0％(P＜0.01)，Bax的蛋白表达量比0μmol/L组显著降低了31.4％(P＜0.01)，P53和PUMA的蛋白表达水平均显著低于未添加组(P＜0.01)。通过RT-qPCR和Western blot对mRNA和蛋白的检测，说明热应激激活了奶牛乳腺上皮细胞内JNK激酶的活性，使磷酸化的JNK急剧升高，并进一步磷酸化使Bcl-2失活，增加了Bax的促凋亡作用，导致细胞内产生不可修复的DNA损伤，介导P53蛋白在DNA受损部位的大量聚集，上调PUMA的表达，引起奶牛乳腺上皮细胞的严重凋亡。利用JNK特异性抑制剂处理后，这些现象均得到抑制，缓解了细胞的凋亡损伤。
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