摘要
菊花（Chrysanthemum morifolium Tzvel.）是我国十大传统名花和世界四大切花之一，因其多姿多彩的形态和丰富的文化内涵而深受人们的喜爱。栽培菊花是由菊属内多个野生种相互杂交形成的异源多倍体，遗传背景比较复杂。甘菊（Chrysanthemumlavandulifoium）为菊属二倍体野生种，遗传背景简单，是栽培菊花的供体亲本之一，具有耐盐、抗病虫害等优良特性。多倍体在物种起源及作物生产中起着重要作用，不仅可以提高产量、改善品质，还可以提高植物对生物和非生物胁迫的抵抗能力等，一直是研究的热点。多倍体形成过程，其基因组结构和基因的转录水平会发生一系列改变，目前相关的研究多集中在异源多倍体化过程，而有关同源多倍体的报道较少。本研究对甘菊同源多倍体化过程的基因组结构及表型变化的机理进行了研究，为菊属植物进化及多倍体的育种利用提供理论依据。主要内容及结论如下: 1.以甘菊试管苗为材料，通过秋水仙素诱导同源四倍体。与二倍体相比，四倍体甘菊株高、叶片、管状花和舌状花均表现出巨大化，叶片变大主要是由于细胞变大和细胞数量增加引起。甘菊同源四倍体化过程，基因组结构和基因的转录均发生了一定程度的改变。DNA-SRAP（DNA Sequence-Related Amplified Polymorphism）标记共扩增出440条条带，有1.6％是新条带，1.1％的条带发生了丢失;cDNA-AFLP(cDNA AmplifiedFragment Length Polymorphism)分析发现，四倍体中有8％转录本（Detectable Transcript-derivedFragments，DTFs）表达上调，5.9％ DTFs表达下调;MSAP(Methylation SensitiveAmplification Polymorphism)分析二倍体和四倍体甘菊甲基化变化，共检测到516个位点，其中有53个位点在多倍体形成后发生了变异，以甲基化升高为主。 2.NAC转录因子参与植物生长发育，利用RACE-PCR技术克隆得到了甘菊9个NAC家族成员，其中ClNAC84在二倍体甘菊叶片中的表达量显著高于四倍体。分析表明，ClNAC84全长893 bp，开放阅读框(ORF)687 bp，共编码229个氨基酸，定位在细胞核中。同源基因氨基酸序列比对显示，ClNAC84包括A，B，C，D，E和F六个亚结构域，其中D亚结构域含有“FVFY”疏水氨基酸。系统进化树分析表明，ClNAC84转录因子与拟南芥NAC84亲缘关系较近，属于NAC家族第二类中的TERN亚类，可能与生长发育相关。荧光定量PCR分析表明，在二倍体甘菊叶片和花中，ClNAC84相对表达量较高，根和茎中相对表达量较低;在四倍体甘菊的花中ClNAC84相对表达量最高，叶片，根和茎次之，二倍体甘菊叶中ClNA C84相对表达量高于四倍体。 3.为了验证ClNAC84基因的功能，构建pESP M-ClNA C84酵母表达载体，转入裂殖酵母菌株SPQ中，超表达菌株较空载体菌株生长缓慢，且细胞表现出多核现象，推测ClNAC84基因可能通过减缓细胞周期而抑制酵母的生长;同时构建了pMDC43-ClNA C84超表达载体，并建立甘菊遗传转化体系，通过根癌农杆菌介导法转化二倍体甘菊，经潮霉素筛选和PCR鉴定后，共获得6个超表达株系，转化率为0.6％。将超表达株系和二倍体野生型甘菊栽到花盆中，16周后观察表型，超表达植株株高、主枝顶部向下的第三片叶面积、叶片长度、宽度、花序直径、花心直径、管状花和舌状花长度均小于野生型甘菊。利用高效液相色谱仪测定内源激素含量，超表达株系ABA含量显著上升，IAA含量下降，与超表达株系形态分析相吻合。通过石蜡切片法观察叶片解剖结构，发现栅栏组织上表面细胞大小未发生变化，但细胞数量却减少，说明叶片变小是由于细胞数量减少引起。 4.通过酵母双杂交系统筛选ClNAC84互作蛋白，共筛选出79个候选蛋白，其中参与细胞分裂的相关蛋白占36.8％，参与抗性胁迫和防御的蛋白占25.0％，参与光合作用的蛋白占11.8％，参与核酸合成的蛋白占6.6％，此外还包括19.7％的其他蛋白，MIP蛋白出现次数最多（13次）。经过酵母双杂交技术(H2Y)和双分子荧光互补（BiFC）验证，ClNAC84与MIP互作，MIP定位在细胞核内，进一步说明两蛋白互作，共同调控甘菊细胞分裂周期。
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