摘要
H4亚型禽流感病毒在全球范围均有流行且宿主广泛，除感染自然宿主野鸟外，该亚型病毒可感染鸡、鸭等家禽，甚至猪、海豹等哺乳动物。在中国的活禽市场，多种家禽长期混养，为禽流感病毒的重组、传播及跨宿主感染提供了便利条件。多种亚型的禽流感病毒共存，使得H4亚型禽流感病毒的重组变异率明显提高，然而，H4亚型禽流感病毒的遗传演化及对禽和哺乳动物致病的分子机制研究尚少。 本研究首先对分离自发病鸭场和活禽市场的8株H4亚型禽流感病毒进行了氨基酸序列分子特征和遗传进化分析。序列分析发现，8株病毒的HA基因具有相同的裂解位点序列(PEKASR/GLF)，表明病毒均表现为低致病性;受体结合位点的分子特征表明8株病毒均倾向与禽源α-2，3-唾液酸受体结合。HA和NA蛋白的潜在糖基化位点均较保守，且NA茎部结构均未发现缺失。PB2蛋白与哺乳动物致病性相关的位点均未发现突变。除了毒株MH-2/H4N6、44-2/H4N6、46-2/H4N6和67-2/H4N6的M2蛋白出现了V27I的突变外，其他毒株均未发现抗性基因，提示某些H4亚型毒株已获得了针对金刚烷胺类药物的抗药性。29-1/H4N2毒株编码含58个氨基酸的PB1-F2蛋白，其余毒株均编码91个氨基酸，此外，毒株421-2/H4N6的PB1-F2蛋白出现了N66S的突变。遗传进化分析表明，所有毒株的八个基因都分布在欧亚分支，且分为两个小的分支，国内优势流行株HA基因分属Group1;分离自鸭场的毒株MH-2/H4N6的八个基因均与分离自活禽市场的三株病毒（44-2/H4N6、46-2/H4N6和67-2/H4N6）有较近的亲缘关系，提示在养殖场与活禽市场之间存在流感病毒传播的现象。另外两株活禽市场分离株（408-1/H4N6和420-2/H4N6）的HA、NA、PB2、NP和NS基因与毒株MH-2/H4N6的相应基因亲缘关系较近，其他几个基因(PB1、PA和M)与另外几个分离株有密切的亲缘关系，提示鸭场分离株与活禽市场分离株之间存在基因重组的现象。 为了探讨H4亚型禽流感病毒对不同类型宿主的致病性，选取水禽模型-鸭、陆禽模型-鸡以及哺乳动物模型-小鼠，分别进行了病毒感染实验。从实验结果可以看出，H4亚型禽流感病毒没有引起实验动物表现临床症状。在鸭体内均可复制，部分毒株获得在鸡体内的复制能力，某些毒株对禽具有广泛的组织嗜性。所有分离株均可在鸭群间通过直接接触传播，但是在鸡群间的传播能力则很有限。8株病毒可以在小鼠肺脏中复制，表明水禽来源的H4亚型禽流感病毒未经适应就可以感染哺乳动物模型-小鼠，提示其跨宿主感染的可能。 根据上述实验结果，将一株在小鼠体内复制能力较低的毒株（29-1/H4N2，简称DK29）在小鼠肺脏进行适应性传代，获得了可以使小鼠死亡率达100％的突变适应株MA-50，每隔5代选取一株适应毒株对其序列及对小鼠的致病性进行分析，并对亲本毒DK29和小鼠适应毒株MA-20、MA-50在不同温度下在DF1、MDCK及A549细胞上的复制能力进行了对比分析。通过测序比对亲本株DK29与适应株病毒MA-50的基因组序列差异，八个基因都出现了氨基酸位点的突变。对小鼠的致病性分析发现，第五代开始病毒在小鼠肺脏中的复制能力便显著增强，各传代适应毒株的毒力随代次增加而增强，25代时可以引起小鼠死亡，到第50代时毒株对小鼠的致死率可达100％。病毒在不同细胞的生长曲线可以看出，小鼠适应株在禽源细胞与哺乳动物细胞的复制能力均强于亲本毒株。在37℃条件下，亲本毒株与小鼠适应毒株在MDCK细胞的复制能力并未表现明显差异，而在33℃条件下小鼠适应毒株的复制能力显著高于亲本毒株，小鼠适应毒株MA-50对哺乳动物细胞的感染能力增加。 在此基础上，为阐明H4亚型禽流感病毒跨宿主感染并致死哺乳动物的分子机制，首先建立了毒株DK29和MA-50的反向遗传操作系统。借助该反向遗传操作系统，分别以两株病毒为背景进行了表面基因（HA和NA）与内部基因（PB2、PB1、PA、NP、M及NS）组合的替换，以及聚合酶基因（PB2、PB1、PA和NP）与另外四个基因（HA、NA、M和NS）组合的替换，获得四株重组病毒，对小鼠致病性的影响显示，病毒的表面基因和内部基因均对其致病性有影响。然后将两个毒株的8个基因片段进行相互替换，拯救得到分别以DK29和MA-50为背景的单基因替换重组病毒，通过小鼠感染实验进行验证，发现DK29毒株的PB2、PA或HA替换为MA-50的相应基因后拯救到的重组病毒在小鼠体内复制能力显著增强，且PB2或PA替换后的重组毒株感染小鼠后MCP-1表达量显著增加。另一方面，MA-50的PB2或(HA+NA)替换为DK29的相应基因后拯救到的重组病毒对小鼠的致死率降低，而其他几个基因替换后的重组毒株依然可以100％致死小鼠。MA-50背景下替换了(HA+NA)基因后的重组病毒感染小鼠后细胞因子IL-6及IFN-β/γ表达水平表现出非常显著的降低，且PB2或PB1基因替换后的重组病毒的IFN-β/γ表达水平显著低于MA-50感染组，表明炎症反应减轻。综合所有结果分析表明影响病毒跨宿主感染并致死小鼠的主要基因是PB2和HA。并且，HA通过改变病毒的受体结合特性影响了病毒的毒力，PB2通过影响病毒的聚合酶活性对病毒的致病力产生影响。根据DK29和MA-50毒株PB2和HA基因的氨基酸差异，通过点突变技术构建相应的质粒，分别以DK29和MA-50毒株为背景拯救含单点突变的病毒，通过感染小鼠发现在两个毒株背景下，PB2蛋白的701或680位点突变均显著影响了病毒的聚合酶活性，从而影响病毒对小鼠的致病性，初步阐述了H4亚型禽流感病毒跨宿主感染并致死小鼠的分子基础。
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