摘要
β-葡萄糖苷酶在饲料工业、食品工业、生物合成以及生物燃料等领域具有重要的应用价值。尤其在目前以玉米豆粕型日粮为主的饲料领域，β-葡萄糖苷酶可以将结合型大豆异黄酮转化为游离型活性苷元，从而发挥其促进动物生长及加速蛋白合成等功效，但β-葡萄糖苷酶的转化过程受肠道中较高浓度葡萄糖的抑制作用。研究表明，和GH3家族相比，GH1家族β-葡萄糖苷酶不仅具有较高的葡萄糖耐受性，而且一定浓度范围内的葡萄糖对其具有酶活促进效应，可以有效促进动物肠道中大豆异黄酮的水解，所以提高饲料利用率上GH1家族β-葡萄糖苷酶具有巨大应用潜力。 本研究从嗜酸耐热菌Alicyclobacillus sp.A4中克隆得到一个GH1家族β-葡萄糖苷酶基因Asbg1，并在大肠杆菌表达宿主中进行了高效异源表达和镍离子纯化。性质测定表明:AsBG1是一个典型的中温偏酸性β-葡萄糖苷酶，其最适pH为6.5，在pH5.5-7.0具有80％以上的酶活，在pH5.0-10.0具有良好的pH稳定性。最适温度为55℃，在50℃热稳定性良好。AsBG1具有宽泛的底物特异性，对芳香类(pNPG、大豆苷)，寡糖类（纤维寡糖、昆布寡糖）和多糖类底物（大麦葡聚糖、地衣多糖等）底物具有活性。动力学参数测定表明，AsBG1对pNPG和纤维二糖的Km分别为0.4和7.3 mM，kcat/Km分别为215和9 s-1·mM-1。 对AsBG1的耐受性进行了系统的测定:以2 mM pNPG为底物时，AsBG1对多种单糖（葡萄糖、乳糖、阿拉伯糖、果糖）都具有较强的耐受性，其对葡萄糖的半抑制浓度IC50为800 mM，0-200 mM葡萄糖对其酶活具有显著促进作用（最高120％），但10mM的pNP则抑制其40％的酶活;以2mM纤维二糖为底物时，10 mM的葡萄糖和pNP分别抑制其60％和70％的酶活。初步表明AsBG1的高葡萄糖耐受性只针对疏水性底物。 为了进一步提高AsBG1的葡萄糖耐受性，本研究通过同源建模、序列比对、分子对接技术等生物信息学手段，聚焦于催化通道内葡萄糖的非活性结合位点，进行了AsBG1的单点突变分子改造。对不同突变体的关键性质测定表明:100mM葡萄糖对WT、H315R和M325K酶活促进作用分别为125％、163％、162％;以1mM大豆苷为底物，10 mM的葡萄糖对WT、H315R和M325K分别具有163％、212％和226％的促进作用，因此可以更有效地促进单胃动物肠道内大豆异黄酮的水解效率，同时对该家族相关耐受性机制的研究具有重要的指导意义。
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