摘要
海藻糖是一种无还原性双糖，分子式是C12H22O11?2H2O，广泛分布于自然界中许多生物细胞中。海藻糖是一种生物应激代谢产物，在一些极端环境生长的古生菌、真菌，以及生长在不良环境中的动植物细胞中海藻糖含量较高。海藻糖在生物细胞中的作用是保护细胞抵抗不良环境的影响，并且可以作为细胞供能物质，其功能是保护细胞质膜，蛋白质、核酸等生物大分子空间结构和功能活性，维持细胞渗透压和防止细胞内营养成分流失。由于海藻糖具有以上功能，可用于医学生物制品中起到保护剂的作用；同时海藻糖也可以用于增强农作物抗逆性，通过转基因手段来培育耐盐碱型农作物，培育抗冻果蔬等；同时，海藻糖不具有还原性，不会发生美拉德反应，可以作为稳定的添加剂应用于食品工业。因此，对海藻糖进行研究具有重要意义。 工业上普遍采用酶法来生产海藻糖，该方法生产效率较高，并且无污染，节约能源，省时省力。酶法生产海藻糖的关键在于获得活性较高的海藻糖合成酶，目前在微生物细胞中总共发现了7种海藻糖合成酶共5条合成途径，分别是海藻糖合酶途径（TreS途径）、TreYZ途径、OtsAB途径、TreT途径和TreP途径。从目前研究方向来看，主要集中于寻找含有海藻糖合成途径的菌株并进行改良获得海藻糖高产菌株，从中直接提取海藻糖或者海藻糖合酶，改良手段主要包括传统诱变、以及基因工程改良，两种方法都可以获得高产突变株。 本研究以细胞内含有3条海藻糖合成途径（TreS途径、TreYZ途径、OtsAB途径）共5种酶（TreS,MTSase,MTHase,TPS,TPP）的谷氨酸棒状杆菌（Corynebacterium glutamicum）作为出发菌株，采用传统紫外-化学药物诱变方法获得海藻糖高产突变株，然后进行细胞内海藻糖合成酶的提取并对酶性质进行分析，再进行培养基以及发酵环境条件的优化获得最佳培养条件。经过实验改良以后的突变株在最佳优化培养条件下的海藻糖合酶产出为621U/mL，较优化之前提高了1.88倍，并且突变株具有良好的遗传稳定性。 （1）经过传统诱变处理后所获得突变株，其海藻糖生产能力得到大幅度提高，达到1.28g/100g干重·h-1，出发野生型菌株生产能力为0.45g/100g干重·h-1。经过传代试验结果表明，突变株具有良好的遗传稳定性。主要实验结果如下： （2）通过对酶性质进行分析可以有效的利用合成酶来生产海藻糖，海藻糖合酶具有可逆的酶活性，对其催化反应条件进行正交试验优化，得到最佳反应条件，在最佳催化反应条件下，海藻糖合酶由麦芽糖向海藻糖的转化率为81.1%。海藻糖合酶、MTSase、MTHase、TPS和TPP酶最适反应pH值分别为：7.0,7.5,6.5,6.5,7.5，酶最适pH范围分别为：pH6.5-8.0,pH6.5-7.5,pH6.0-7.5,pH6.0-7.5,pH6.5-8.0。酶最适反应温度分别为35℃,35℃,40℃,35℃,35℃，酶最适温度范围为：30-35℃,35-40℃,30-45℃,25-40℃,30-35℃。 （3）使用析因设计（FFD）—中心复合设计(CCD)对培养基组分进行优化，以期得到最大海藻糖合酶产出，首先通过析因设计得到对响应值有显著影响的因素，然后进行CCD设计找到最佳培养基组分方案。得到最佳培养基组分为：麦芽糖22.00g/L，牛肉膏7.49g/L，NaCl13.36g/L，K2HPO411.33g/L，蛋白胨15.00g/L。通过单因素试验得到最佳发酵条件为pH7.0，接种量为108个/mL，发酵温度34℃，在培养种龄30h后提取海藻糖合酶，摇床转速为200rpm，选择装液量70mL/250mL三角瓶进行摇瓶发酵，所得最终海藻糖合酶最高酶活为621U/mL。
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