摘要
浮萍科（Lemnaceae）包括5个属（Spirodela,Landoltia,Lemna，Wolffiella，Wolffia），共37个种。作为一种分布广泛，最小的开花植物，浮萍以无性繁殖为主，生长速度极快，营养需求简单，在实验室易培养，基因组较小。既可作为一种新型的基因功能研究的模式植物，又可作为一种理想的植物生物反应器。研究、利用浮萍资源，建立浮萍稳定遗传转化体系是必不可少的基础研究内容。本研究以绿萍、少根紫萍、芜萍为材料，研究农杆菌介导的叶状体直接转化与愈伤遗传转化方法，并对两种转化方法进行检测与评估，为浮萍资源利用打下良好基础。研究内容和结果如下: 一、浮萍稳定遗传转化方法的建立 1.浮萍对抗生素G418敏感性研究。不同品种绿萍对抗生素G418抗性具有显著差异，绿萍L.japonica ZH0150、ZH0091对G418抗性较强;绿萍L.minor M0165、ZH0055、D0158与L.aequinoctialis ZH0004对G418敏感。实验得出株系M0165、D0158、ZH0004、ZH0055的G418筛选阈值分别为10mg/L、15mg/L、20mg/L、30mg/L。 2.愈伤组织诱导研究。对绿萍L.minor D0158、ZH0055、M0165，少根紫萍L.punctata ZH0051、ZH0064、ZH0188进行愈伤诱导。绿萍L.minor ZH0055两个月后形成愈伤组织，诱导率达到92％。其余浮萍株系在生长点附近诱导出瘤状突起物，去分化程度未达到要求。 3.根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）介导的叶状体直接遗传转化。直接侵染叶状体法转化10个浮萍株系，GUS染色显示不同属浮萍瞬时转化率存在显著差异。绿萍L.minor M0165、ZH0055、D0158瞬时转化率为30～40％;绿萍L.japonica ZH0150、ZH0091与少根紫萍L.punctata ZH0051、ZH0064、ZH0188瞬时转化率为10～17％;芜萍W.globosa D0080未检出GUS活性。对瞬时转化率相对较高的绿萍株系L.minor M0165、ZH0055、D0158进行条件优化，结果表明预处理时绿萍L.minor D0158、M0165添加0.02％的表面活性剂Silwet L-77可将瞬时转化率提高19％，但Silwet L-77对ZH0055无显著影响;金刚砂振荡创伤法相对解剖刀划伤法不会降低瞬时转化率，但节省时间;共培养天数对3株绿萍瞬时转化率影响不显著。 4.根癌农杆菌介导的绿萍愈伤组织遗传转化。根癌农杆菌转化绿萍L.minor ZH0055愈伤组织，GUS染色检测瞬时转化率为89％。 二、转基因植株外源基因表达分析 1.转基因植株外源基因CYP710A11的PCR检测与GUS活性检测。经3个月筛选得到18个G418抗性株系，分别是由愈伤转化后再生的绿萍L.minor ZH0055，包括13个株系;直接转化叶状体形成的5个株系。PCR结果表明在所有转化株系中均含有外源基因CYP710A11，GUS染色结果表明外源基因gus均已整合到各个绿萍基因组中并表达。 2.外源基因相对拷贝数与表达量检测。采用多重PCR以绿萍L.minor内源单拷贝基因RNR2B为内参，比较基因mCYP710、gus、CYP710A11、NptⅡ的扩增效率，在此基础上检测各个转化株系外源基因NptⅡ相对拷贝数;结合反转录PCR，以基因RNR2B为内参检测mCYP710、gus、CYP710A11、NptⅡ相对表达量。对10株转基因株系外源基因插入表达情况分析，植株1-1、2-1、2-2、2-3、2mp3外源基因可能是单拷贝，2mp12为2拷贝，2mp5、2mp13为3拷贝，mp2、5-1为4拷贝。内源基因mCYP710在各个株系中相对表达量变动幅度不大;外源基因NptⅡ在各个株系中相对表达量极高，难以比较不同株系之间差异;外源基因CYP710A11扩增效率低，难以反应真实表达量;相对内参基因RNR2B，外源基因gus扩增效率和表达量较为适中，能比较准确的反应各个转基因株系中外源基因相对表达量。 3.外源基因插入位点检测。采用TAIL-PCR得到两个转基因株系2-1、5-1的T-DNA插入位点，T-DNA未发生序列丢失，载体多余序列未插入绿萍基因组，两个株系T-DNA的插入位点都位于绿萍基因富集区，插入未对绿萍基因造成破坏。 综上，对于浮萍稳定遗传转化方法的研究，证明直接转化法更具优势:可用于难诱导愈伤的浮萍株系的遗传转化，实验操作简单，节省时间。本研究得到了两种转化方法来源的能稳定遗传的转基因绿萍株系，并初步得到了10个转基因植株外源基因相对拷贝数与表达量，为浮萍的资源利用研究提供参考。分析了转基因绿萍T-DNA插入表达情况，并得到了其中两个株系T-DNA插入位点，为浮萍外源基因表达研究提供了重要的参考信息。
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