摘要
(S)-N-Boc-3-羟基哌啶((S)-NBHP)作为一种手性醇，是合成多种手性药物的关键中间体，如非天然药物卡普瑞林，美国食品与药物管理局(FDA)批准首创抗癌新药依鲁替尼(一种Bruton's酪氨酸激酶(BTK)抑制剂）。传统制备(S)-N-Boc-3-羟基哌啶采用化学法，其高成本、高能耗、高污染的缺点限制了其工业应用。而以N-Boc-3-哌啶酮作为潜手性底物的生物酶催化法制备(S)-NBHP由于其生产成本低、反应条件温和、污染较低，逐渐得到研究者重视。然而目前已报道的能够不对称催化N-Boc-3-哌啶酮合成(S)-NBHP的酶十分少，因此继续挖掘具有催化合成(S)-NBHP能力的酶是目前研究的重点。 本研究通过基因组数据挖掘的方法，筛选得到了来自于近平滑假丝酵母的羰基还原酶CprCR。对其密码子优化后，构建重组质粒pET-28a-CprCR转化至大肠杆菌Rosetta中高效表达，酶活测定显示其粗酶液对底物N-Boc-3-哌啶酮的活力为5.04U/mL发酵液。在添加乙酸丁酯的双相催化体系将CprCR粗酶液用于催化N-Boc-3-哌啶酮合成(S)-NBHP，添加辅酶NAD+、葡萄糖脱氢酶和辅底物葡萄糖用于辅酶再生。反应温度30℃，使用pH=7.0的缓冲液，定时补加1M NaOH调控pH，24h后，20～80 g/L的底物最终转化率均能达94％，产物(S)-NBHP的光学纯度e.e.值＞99％，这表明其具有很高的活性和立体选择性。 将酶CprCR经过镍柱纯化后，对其酶学性质进行了系统研究:CprCR作为NADH辅酶依赖型羰基还原酶，动力学参数测定显示其催化底物N-Boc-3-哌啶酮的米氏常数Km值为2.3 mM，最大反应速率Vmax为19.08 mmol/L/min，kcat数为23.1s-1。底物谱测定表明其对一些醛酮类化合物也有一定催化活性，特别是呈线性的底物活力更高。CprCR酶的最适反应温度在50℃至55℃之间，最适pH在6～7之间。当温度在40℃以下及中性条件下(pH6～8)酶更稳定。部分金属离子对酶有激活作用，如Mg2+、Mn2+、Li+和Na+等，而Cu2+、Fe2+和Fe3+的存在会使酶活彻底丧失。多种有机溶剂对CprCR酶活均有抑制作用，其中二氯甲烷、正丁醇、领苯二甲酸二丁酯对酶活抑制作用相对较小。 构建羰基还原酶CprCR与葡萄糖脱氢酶BmGDH共表达的重组细胞Rosetta-pET-28a-CprCR-GDH，并以葡萄糖为辅底物，构建双酶偶联催化体系。通过不同条件的催化实验研究，确定了最佳催化方式为:以双酶共表达的全细胞作催化剂，选用乙酸丁酯作为双相催化体系的有机相，pH调控方式为反应过程补加NaOH溶液。研究Zn2+、辅酶、葡萄糖浓度、菌体浓度这四个基本的催化条件对双相体系中转化高浓度(100g/L)的N-Boc-3-哌啶酮的影响。结果在最适条件下（反应温度30℃，菌体浓度80 g/L，Zn2+浓度4mg/L，pH=7.0的缓冲液），6h反应结束，对底物转化率达到约95％，且光学纯度e.e.值大于99％。尝试利用单一水相体系提高最终转化率，解除有机溶剂对酶活抑制效应。结果在N-Boc-3-哌啶酮浓度为100 g/L时，30℃下反应14h结束，转化率达到98％，e.e.值＞99％。相对于相同催化条件的没有添加Zn2+的双相催化体系，水相反应速率更快，且最终转化率提高了18％。 通过序列比对、同源建模、分子对接等蛋白质工程手段，以CprCR与底物的复合物模型为基础，基于减小空间位阻的原理对影响活性的关键残基55位亮氨酸和285位苯丙氨酸进行定点突变，以期得到双相催化体系中CprCR催化活力提高的酶。结果得到了在水-乙酸丁酯双相催化体系中催化效率更高的突变体L55A，相比野生菌，最终转化率提高了20％，达到了98％。
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