摘要
龙眼（Dimocarpus longan Lour.）又称桂圆，属无患子科龙眼属，是我国南方一种特色果树。它富含类黄酮、类胡萝卜素多种营养和功效成分，具有重要的药用价值。龙眼胚性愈伤组织（EC）具有增殖速度快、生长能力强和再生频率高等优点，是研究龙眼体细胞胚胎发生和次生代谢的理想材料。本试验以龙眼‘红核子’胚性愈伤组织为材料研究了基本培养基、激素和培养时间对龙眼EC增殖、类黄酮和类胡萝卜素及其合成相关基因表达的影响，以期为龙眼EC类黄酮和类胡萝卜素合成研究奠定基础。具体结果如下： 1.基本培养基对龙眼愈伤组织增殖和类黄酮积累的影响。以龙眼EC为材料，采用单因素试验设计，研究不同基本培养基（MS、1/2MS、1/4MS和B5）对龙眼EC增殖、类黄酮和类胡萝卜素含量的影响。结果显示，不同培养基中EC的增殖率由高到低依次为：MS＞1/2MS＞B5＞1/4MS，其中，使用MS作为基本培养基时EC的增殖系数最高，达17.48；类黄酮含量由高到低分别为：MS＞1/2MS＞B5＞1/4MS，其中，使用MS作为基本培养基时，龙眼EC中类黄酮的含量可达5.06 mg/g。结果表明，MS培养基最有利于龙眼EC的增殖和类黄酮的累积，而1/4MS培养基效果最差。 2.激素对龙眼愈伤组织增殖、类黄酮和类胡萝卜素积累的影响以龙眼EC为材料，采用正交试验设计，研究激素对龙眼EC增殖、类黄酮和类胡萝卜素积累的影响。结果发现，激素对龙眼EC增殖的影响效应由高到低依次为：2,4-D＞AgNO3＞KT，其中处理组5（MS+2,4-D1.0 mg/L+KT0.50 mg/L+AgNO37.5 mg/L）最有利于愈伤组织的增殖，其次是处理组6（MS+2,4-D1.0 mg/L+KT0.75 mg/L+AgNO32.5 mg/L），增殖系数分别达到24.50和23.82，而处理组7（MS+2,4-D1.5 mg/L+KT0.25 mg/L+AgNO37.5 mg/L）和处理9（MS+2,4-D1.5 mg/L+KT0.75 mg/L+AgNO35.0 mg/L）中愈伤组织增殖效果最差，增殖系数仅为10.38和9.85。 通过研究不同激素处理对类黄酮含量和产量的影响发现，处理组8（MS+2,4-D1.5 mg/L+KT0.50 mg/L+AgNO32.5 mg/L）中类黄酮含量最高，高达4.24 mg/g，而处理组7（MS+2,4-D1.5 mg/L+KT0.25 mg/L+AgNO37.5 mg/L）最差，仅为1.85 mg/g。不同激素对类黄酮含量影响的主次顺序为：KT＞2,4-D＞AgNO3；不同激素对类黄酮产量积累的影响效应由高到低依次为2,4-D＞ KT＞AgNO3；最适宜龙眼类黄酮生产最佳配方处理组5（MS+2,4-D1.0 mg/L+KT0.50 mg/L+AgNO37.5 mg/L）。 通过研究不同激素处理中对类胡萝卜素含量和产量的影响发现：处理组1（ MS+2,4-D0.5 mg/L+KT0.25 mg/L+AgNO32.5 mg/L）中类胡萝卜素的积累效果最好，含量可达25.75μg/g，而处理组4（MS+2,4-D1.0 mg/L+KT0.25 mg/L+AgNO35.0 mg/L）最差，类胡萝卜素的积累量仅为9.5μg/g；不同激素类胡萝卜素产量积累的影响效应由高到低依次为：AgNO3＞2,4-D＞KT，其中处理组1（ MS+2,4-D0.5 mg/L+KT0.25 mg/L+AgNO32.5 mg/L）和5（MS+2,4-D1.0 mg/L+KT0.50 mg/L+AgNO37.5 mg/L）中类胡萝卜素产量较大。最适宜龙眼类胡萝卜素生产的最佳配方为处理1（ MS+2,4-D0.5 mg/L+KT0.25 mg/L+AgNO32.5 mg/L）。综上所述及分析得出最适宜龙眼类黄酮及类胡萝卜素增殖、含量和产量的配方 3.培养时间对龙眼愈伤组织增殖、类黄酮和类胡萝卜素积累的影响。基于2的结果，采用单因素试验设计，研究培养时间对龙眼EC增殖以及类黄酮和类胡萝卜素积累的影响，发现龙眼EC增殖系数高低依次为：10 d＞15 d＞20 d＞7 d；类黄酮含量高低顺序为：10 d＞15 d＞7 d＞20 d，其中培养10 d时类黄酮含量最高，高达4.2 mg/g；类黄酮产量高低顺序依次为：10 d＞15 d＞7 d＞20 d；类胡萝卜素含量高低顺序依次为：7 d＞15 d＞20 d＞10 d，其中培养7 d时类胡萝卜素含量最大，为25.12μg/g，其相应产量高低顺序依次为：7 d＞10 d＞15 d＞20 d。最佳配方为处理1（MS+2,4-D0.5 mg/L+KT0.25 mg/L+AgNO32.5 mg/L）。综合分析，培养10 d最有利于龙眼EC的增殖和生长以及类黄酮和类胡萝卜的积累。 4.龙眼愈伤组织类黄酮和类胡萝卜素合成相关基因的表达模式分析。以FSD、EF-1a、EIF-4a为内参基因，使用实时定量PCR技术研究了在不同培养基、不同激素处理和不同培养时间下类黄酮合成相关基因CHS、CHI、DFR和F3H基因以及类胡萝卜素合成相关基因GGPS、PSY、ZDS和PDS在不同处理下的表达模式。 通过研究不同基本培养基对这些基因的表达的影响，发现：类黄酮合成相关的CHS、CHI、F3H基因在不同基本培养基中的表达水平由高到低依次为：1/2MS＞MS＞1/4MS＞B5，而DFR基因在不同基本培养基中的表达水平由高到低依次为：B5＞ MS＞1/2MS＞1/4MS；类胡萝卜素合成相关基因GGPS、PSY、ZDS和PDS基因均在1/2MS培养基中的表达量最高。 通过研究不同激素处理对这些基因的表达的影响，发现：类黄酮合成相关的CHS、CHI、F3H和DFR基因表达差异较大，其中CHS基因在处理8（MS+2,4-D1.5 mg/L+KT0.50 mg/L+AgNO32.5 mg/L）中表达量最高，CHI和DFR在处理6（MS+2,4-D1.0 mg/L+KT0.75 mg/L+AgNO32.5 mg/L）中表达量最高，F3H在处理9（MS+2,4-D1.5 mg/L+KT0.75 mg/L+AgNO35.0 mg/L）中表达量最高；而类胡萝卜素合成相关的GGPS、PSY、ZDS和PDS基因均在处理9（MS+2,4-D1.5 mg/L+KT0.75 mg/L+AgNO35.0 mg/L）中的表达量最高。 通过研究不同培养时间对这些基因的表达的影响，发现这些基因在培养10 d时表达量均为最高。
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