摘要
镉(Cd)是生物毒性极强的重金属之一，过量Cd进入环境参与水体-土壤-生物系统循环，不仅直接影响作物生长发育，并可通过食物链使人体被动地摄入，严重威胁人类健康。萝卜（Raphanus sativus L.）为原产于我国的一种重要根菜类蔬菜作物，不仅营养丰富，而且具有较高的药用食疗价值。萝卜以膨大肉质直根为产品器官，不同基因型萝卜品种Cd吸收累积与转运能力存在显著差异。本室已对萝卜Cd吸收累积性状基因型差异与遗传规律进行了系统分析，然而，萝卜Cd吸收累积性状遗传特征与Cd胁迫响应关键基因分离工作仍尚未开展。鉴于此，本研究构建了萝卜高密度遗传连锁图谱，进行了Cd吸收累积性状主效QTLs遗传作图与定位分析，并在基因组水平分离鉴定了Cd胁迫下重要差异表达功能基因与起重要调控作用的miRNAs。取得主要研究结果如下: (1)以Cd吸收累积差异显著的萝卜高代自交系‘Nau-Dysx’(高Cd)和‘Nau-Yh’(低Cd)组配得到的172个F2单株为作图群体，运用SRAP、RAPD、SSR、ISSR、RAMP和RGA标记技术构建了一张包含523个位点、9个连锁群的萝卜遗传连锁图谱，总遗传距离为1678.2cM，包含248个SRAP、114个RAPD、76个SSR、47个ISSR、26个RAMP和12个RGA标记，标记间平均图距为3.4cM。采用复合区间作图法，本文检测到肉质根Cd累积量相关4个QTLs，分别位于LG1，LG4，LG6和LG9上，可解释9.86～48.64％的表型变异率。主效QTL位点qRCd9，LOD值为23.64，定位于标记NAUrp011_754和EM5me6_286之间，可解释48.64％的表型变异率，表现为超显性，控制肉质根Cd吸收累积的等位基因来自于母本‘Nau-Dysx’。检测到地上部Cd累积量相关2个QTLs，分别位于LG1和LG3上，可解释总表型变异率为46.61％。qSCd3位点LOD值为7.64，定位于标记EM16ga18_383和Na10A08_455之间，可解释29.53％表型变异率，表现为超显性，控制地上部Cd吸收累积的等位基因来自于母本‘Nau-Dysx’。此外，共检测到与根长、株高、主根干重、地上部干重和总干重等农艺性状相关的19个QTLs，可解释4.73～31.42％表型变异率。 (2)为分离萝卜Cd胁迫响应调控网络中差异表达基因，本文通过RNA-Seq技术进行了萝卜肉质根CK和Cd400两个样品数字基因表达谱分析。RNA-Seq测序共获得66，552个可变剪切体，拼接获得31，015个Unigene，平均长度为1241.75bp。分离到Cd胁迫响应差异表达基因2781个，其中上调基因539个，下调基因1565个，占总表达基因的8.97％。GO分析表明，这些差异基因参与能量代谢、离子代谢与结合、胁迫响应及金属离子跨膜运输等生物过程。部分差异表达基因如PCS1，GST，金属硫蛋白MT1和MT3，ABC转运蛋白及锌铁转运蛋白家族（IRT2，ZNT1，ZIP4和ZIP5）等在重金属胁迫响应调控网络中发挥重要作用，并参与谷胱甘肽代谢、金属硫蛋白代谢及ABC蛋白跨膜转运等多个pathway调控网络。qRT-PCR分析准确验证了PCS1、MT1和IRT2等重金属胁迫响应基因上调或下调表达特征。其中，RsMT1和RsMT3基因组DNA全长分别为376bp和609bp，ORF长度分别为138bp和201bp，分别可编码45个和66个氨基酸，其氨基酸序列均含有高比例的Cys残基。RsMT1和RsMT3编码氨基酸序列分别与油菜BnMT1与芥菜BjMT3蛋白同源性最高。RsMT1和RsMT3基因均在根中相对表达量最高;根部表达量随Cd浓度升高呈现上调表达，100mg/L和150mg/L相对表达量分别为CK的3.8和4.0倍，在400mg/L时表达量稳定;二者分别在48h和96h表达量最高，为CK的3.5和3.7倍。利用基因组DNA步移法，分离克隆到RsMT1基因5'上游区834bp启动子序列，包含CAAT-box和TATA-box等顺式作用元件，主要参与萝卜生长发育及部分生物及非生物胁迫响应过程。 (3)以萝卜高代自交系‘NAU-RG’为材料，分离克隆到萝卜络合素合成酶基因RsPCS2。该基因cDNA全长1538bp，包含1449bp的开放阅读框(ORF)，可编码482个氨基酸，具有2个明显的疏水区和跨膜结构域。RsPCS2基因与油菜BnPCS2蛋白同源性高达92.8％。RT-PCR与qRT-PCR分析表明，RsPCS2基因在萝卜根和须根中表达量明显高于叶片和茎，且随Cd浓度升高和胁迫时间延长呈现明显上调表达，150mg/L相对表达量为CK的4.7倍，200mg/L和400mg/L表达量稳定，24h表达量最高，为CK表达量的7.6倍。利用基因组DNA步移法，分离克隆到RsPCS2基因5'上游区1383bp启动子序列，包含CAAT-box，TATA-box和TATC-box等顺式作用元件，主要参与萝卜生长发育及部分生物及非生物胁迫响应过程。 (4)以萝卜高代自交系‘NAU-RG’为材料，分离克隆到萝卜中两个金属阳离子转运蛋白基因。RsIRT2和RsNramp3cDNA全长分别为1097bp和1593bp，ORF长度分别为1038bp和1527bp，分别编码345个和508个氨基酸，二者均为稳定蛋白质。RsIRT2和RsNramp3分别具有8个和11个明显疏水区和跨膜结构域，属于典型膜蛋白。同源性比对表明，RsIRT2和RsNramp3分别与拟南芥AtIRT2和AtNramp3具有较高的同源性。RsIRT2基因具有缺Fe和缺Fe加Cd胁迫诱导表达特性;RsIRT2和RsNramp3基因在不同组织呈现差异表达，根部表达量随Cd浓度升高和胁迫时间延长分别呈现上调表达和不同程度的表达特性，RsIRT2基因200mg/L和48h相对表达量分别为CK的4.6和3.6倍，RsNramp3基因400mg/L和24h相对表达量分别为CK的3.9和6.3倍。 (5)基于Cd胁迫响应基因表达谱分析，分离克隆到萝卜中两个锌铁蛋白(ZIP)家族基因。RsZIP1和RsZIP4基因组cDNA全长分别为1090bp和1307bp，ORF长度分别为1062bp和1263bp，分别可编码353个和420个氨基酸，二者均属于不稳定蛋白质。RsZIP1和RsZIP4基因均具有8个明显的疏水区和跨膜结构域，属于典型膜蛋白。同源性比对表明，RsZIP1和RsZIP4分别与盐芥ThZIP1和遏蓝菜TcZIP4同源性最高。RsZIP1和RsZIP4基因在不同组织中呈现不同程度表达，茎和须根中表达量最高;根部表达量随Cd浓度升高呈现上调表达，400mg/L和150mg/L相对表达量分别为CK的3.9和4.2倍;不同Cd胁迫时间下，二者分别在12h和96h相对表达量最高，分别为CK表达量的3.1和4.0倍，24h和12h后呈现稳定表达。 (6)为系统分离鉴定萝卜肉质根中Cd胁迫响应miRNAs及其靶基因，构建了对照组(CK)和Cd处理组(Cd200)两个miRNA文库。通过Solexa测序技术，分离到26个已知miRNA家族（93个保守型和16个非保守型miRNAs）和22个新型miRNA家族，并在萝卜根、茎、叶、叶柄、花、花蕾等组织中呈现出差异表达。分离鉴定到15个已知和8个新型Cd响应胁迫miRNA，qRT-PCR分析表明，这些差异miRNAs在不同Cd胁迫处理时间（0，1，6，12，24和48h）下呈现出差异表达模式。基于本室肉质根转录组unigene数据，通过降解组测序技术分别鉴定到已知miRNA和新型miRNA的18个和71个靶基因，它们广泛参与植物能量代谢、信号转导、器官发育、细胞分化及非生物胁迫等进程，其中一些靶基因参与植物Cd胁迫响应过程，如植物络合素合酶基因PCS1，ABC转运蛋白和铁转运蛋白。
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