昆虫杆状病毒是一类寄生于节肢动物的双链DNA病原微生物，因其病毒粒子呈长杆状而得名，其宿主主要是鳞翅目、膜翅目、双翅目昆虫。自上世纪末以来，杆状病毒作为新型生物杀虫剂逐渐应用于害虫防治。与化学农药相比昆虫杆状病毒具有安全性高、害虫不易产生抗性并能在田间长期控制害虫种群的优势，但是病毒杀虫速度较慢、杀虫谱较窄限制了其推广应用。因此，通过基因工程手段改造提高杆状病毒的杀虫活性，对于开发新型生物杀虫剂，保护生态环境，促进现代农业发展有重要理论意义和良好应用前景。 本研究围绕新型重组杆状病毒的构建、杀虫活性、稳定性、安全性以及不同启动子对重组病毒杀虫活性的影响等开展研究，主要获得以下结果: 1、重组杆状病毒的构建与杀虫活性。 将从东亚钳蝎中克隆到的兴奋型蝎昆虫毒素基因(BmK IT)与苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(Autographa californica multicapsidu nuclear ployhedrosis virus，AcMNPV)基因组同源重组，得到重组杆状病毒AcMNPV-BmK IT(IE1)，外源基因受极早期启动子IE1promoter调控;将此兴奋型蝎昆虫毒素基因(BmK IT)和从烟草天蛾中克隆到的几丁质酶基因(Chitinase)同时与AcMNPV基因组同源重组，得到双价抗虫重组杆状病毒AcMNPV-BmK IT(IE1)-Chi(IE1)，两个外源基因同时受极早期启动子IE1promoter调控。 将两种重组昆虫杆状病毒和野生病毒感染棉铃虫幼虫，杀虫实验表明重组杆状病毒的杀虫活性明显优于野生型杆状病毒。单价重组病毒杀虫效果较好，在感染病毒浓度为1×106PIBs/mL和1×107PIBs/mL时对3龄期棉铃虫幼虫的半致死时间比野生型病毒分别缩短了12.61％和11.44％;双价病毒在感染病毒浓度为1×106PIBs/mL和1×107PIBs/mL时对3龄期棉铃虫幼虫的半致死时间比野生型病毒分别缩短了9.76％和10.11％。通过曲线拟合，野生型病毒AcMNPV，重组单价病毒AcMNPV-BmK IT(IE1)和重组双价病毒AcMNPV-BmK IT(IE1)-Chi(IE1)的LC50分别为1.87×103，4.08×102，4.64×102;两个重组病毒半致死浓度分别比野生病毒的半致死浓度减少了78.18％和75.19％。实验还初步研究了双价重组病毒AcMNPV-BmK IT(IE1)-Chi(IE1)对不同虫龄棉铃虫的毒力敏感性以及病毒对棉铃虫幼虫的亚致死作用，结果显示双价重组病毒对低龄幼虫更加敏感且对未死亡幼虫有亚致死作用。研究了单价病毒AcMNPV-BmKIT(IE1)对甜菜夜蛾幼虫的杀虫活性，得到结果与单价病毒对棉铃虫幼虫的活性接近。实验为该病毒作为一种新型生物杀虫剂的应用提供理论基础。 2、重组病毒AcMNPV-BmK IT(IE1)-Chi(IE1)的稳定性和安全性。 温度、pH、紫外光对昆虫杆状病毒的稳定性影响非常重要。本实验在4℃-100℃温度范围内研究温度对重组杆状病毒AcMNPV-BmK IT(IE1)-Chi(IE1)的毒力稳定性影响，进而得到该重组杆状病毒的温度稳定性区间为4℃-50℃;研究了pH4.0-9.0时保存病毒的稳定性，结果表明，pH6.0-8.0的病毒液都保持很高的稳定性，杀虫实验中幼虫死亡高峰相对集中，感染全程天数亦有所缩短。降低或升高病毒液的pH值，病毒对棉铃虫幼虫的感染效果均有所下降，死亡高峰相对分散，感染的全程天数也相应延长;实验还从不同浓度病毒液在紫外线照射120min的毒力活性和紫外线照射不同时间的毒力活性等方面对紫外线照射影响病毒AcMNPV-BmKIT(IE1)-Chi(IE1)稳定性进行了研究。 病毒的生物安全性同样是其得以推广应用的一个前提条件。第三章实验中我们以昆明小鼠作为模式哺乳动物，研究了重组病毒AcMNPV-BmKIT(IE1)-Chi(IE1)对哺乳动物的急性毒性实验。将高、低两种不同剂量的重组病毒悬液和野生型病毒悬液灌胃小鼠，观察小鼠的急性毒性反应以及胸腺、脾、肝、肾等主要脏器的颜色、形态、大小、软硬度。将以上表型特征有较明显变化的脏器制作石蜡切片并在光学显微镜下进行组织病理学观察。实验结果显示重组杆状病毒AcMNPV-BmKIT(IE1)-Chi(IE1)对小鼠无毒性，具有安全性。 3、重组病毒的改造及不同启动子对重组病毒杀虫活性的影响 本研究应用Bac to Bac重组表达系统对病毒进行了改造，将蝎昆虫神经毒素基因BmK IT分别重组至多角体蛋白启动子(PH)和P10蛋白启动子(p10)下游，实现外源基因受强启动子调控;克隆AcMNPV多角体蛋白(POLH)基因，并将其插入重组系统杆粒中实现病毒与亲本的完整性。通过重组中间载体的获得、中间载体转化DH10B感受态细胞筛选重组杆粒、重组杆粒与脂质体作用转染昆虫细胞等步骤，最终共获得五种重组病毒AcMNPV-BmK IT(p10)(POLH-)，AcMNPV-BmK IT(PH)(POLH-)，AcMNPV-BmK IT(p10)-BmK IT(PH)(POLH-),AcMNPV-BmK IT(p10)-POLH(PH),AcMNPV-POLH(p10)-BmK IT(PH)。通过ELISA方法研究了几种重组病毒外源蛋白的表达差异，结果显示受PH启动子调控表达的BmK IT基因表达量最大。将重组病毒注射甜菜夜蛾幼虫进行初步杀虫活性研究，重组病毒AcMNPV-POLH(p10)-BmK IT(PH)和AcMNPV-BmK IT(p10)-POLH(PH)杀虫效果比野生病毒分别提高了20.82％and17.79％。研究结果表明重组病毒中外源基因受强启动子调控可获得更好的杀虫效果。
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