摘要
水稻粒型是一个重要农艺性状，既影响产量，也影响稻米品质。粒型主要受粒长、粒宽和粒厚影响，是水稻育种者在品种选育中一个非常重要的指标。一般来说，籼稻品种粒型多为长粒型，而粳稻品种多为圆粒型。 GS3是第一个被克隆的控制大多数籼稻品种长粒的基因。序列分析显示，该基因包含有四个结构域：N端的OSR结构域，该结构域在调节籽粒大小中发挥着重要的功能；一个跨膜区；C端的TNFR/NGFR家族富半胱氨酸以及VWFC结构域。TNFR/NGFR和VWFC结构域对OSR功能具有抑制作用，这两个功能域失活突变会产生超短的籽粒。基因序列同源比对表明，GS3编码一个G蛋白γ亚基，它的OSR结构域同时也是一个GGL结构域。本研究在已有研究的基础上，以粒型基因GS3为研究对象，通过构建中花11品种背景下的CRISPR/Cas9GS3基因半胱氨酸敲除株系，利用分子生物学和组织形态学等研究方法，研究GS3半胱氨酸结构域调控籽粒大小的分子机制及其作为G蛋白γ亚基的生物学功能。主要结果如下： 1.gs3(Os03g0407400)突变体株系的获得 利用CRISPR/Cas9系统对GS3基因半胱氨酸结构域进行定点敲除。通过CRISPR/Cas9系统构建双元表达载体pC1300-Cas9-gGS3，利用农杆菌介导的方法将构建的表达载体转化到中花11。对T0代株系测序分析，发现在22株转基因株系中，有6株靶位点发生突变，3种突变类型，获得的突变类型为单碱基缺失，2个碱基缺失以及34bp的缺失且为移码突变，即获得了GS3半胱氨酸结构域突变的突变体株系。 2.突变体的表型鉴定 对T2代突变体3个不同纯系进行表型鉴定，突变体的籽粒变短，且粒宽变宽，粒长分别降低了27％，13％，20％，粒宽分别增加了5.1％，4.5％，5.7％，千粒重分别减少了19％，15％，23％，株高，穗长及穗粒数没有明显的差异。GS3半胱氨酸结构域被敲除后特定地影响籽粒，而并没有影响其它性状。 3.突变体籽粒的细胞学观察 对gs3突变体和野生型开花前的颖壳进行电镜扫描，突变体中颖壳的细胞数目明显少于野生型，细胞宽度变宽，细胞的面积有所增加；结合突变体和野生型粒型差异，推测水稻粒长的变化是由于细胞分裂引起的。 4.gs3突变体对BR信号途径相关基因的表达量的影响 利用RT-PCR分析野生型及突变体幼穗(2-5cm)中与BR信号途径相关的基因的表达量，其中受体激酶OsBRI1和BR合成途径相关基因表达没有显著差异，而水稻糖原合成酶激酶基因OsGSK1和受BR诱导的生长素应答基因显著上调，说明GS3可能位于OsBRI1下游，并参与了受BR调控的生长素应答因子途径，而与BR合成途径无关。 5.外源BR处理gs3突变体及野生型幼苗 在苗期，对野生型中花11号和gs3突变体株系用不同浓度的BR进行处理，它们的根长均受到抑制，且浓度越高抑制程度越大；同时，对照组(0%BR)中gs3突变体株系与野生型相比根长没有显著差异，而在不同浓度下，gs3突变体的根长明显比野生型的要长，抑制程度明显弱于野生型。因此，gs3突变体表现出对BR敏感度下降。 6.BR处理后根中BR信号途径相关基因的表达分析 选取水稻BR调控通路上的相关基因，通过Real time-PCR方法分析它们在GS3基因突变后的表达变化。与对照组相比，gs3突变体中受BR调控的大部分生长素应答基因表达量有所上调，而经过10-6mol/L的BR处理后，这些基因表达量有所下调。同时，对照组中突变体与野生型的BR合成途径的相关基因变化不明显，BR处理后相关基因的表达也没有显著差异。说明GS3可能参与了受BR调控的生长素应答基因途径，而不涉及BR合成途径。 7.GS3蛋白γ亚基结构域不同位点的互作分析 构建GS3全长及GS3GGL结构域不同截短长度的BD载体，通过酵母双杂的方法与RGB1进行互作分析，全长的GS3蛋白能够与RGB1互作且较弱。而GS3蛋白在33-53位点处与RGB1互作较强，而54-98，56-98处与RGB1不互作，说明33-53这一段氨基酸序列对互作非常重要。
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