摘要
短串联重复序列(Short tandem repeat，STR)是由2～6bp“核心序列”串联重复构成的微卫星DNA，不同个体之间因其核心序列重复数目的变化，构成了STR基因座的遗传多态性。因STR标记重复序列的重复次数相对较少，其片段长度一般小于300bp。STR基因座在人类基因组中含量丰富，平均每6-10kb左右就出现一次，故具有扩增片段小，多态性程度及检测灵敏度高的优势，广泛应用于遗传作图法医学个人识别及亲权鉴定，被喻为第二代法医DNA遗传标记。目前PCR-STR分型已成为各DNA实验室的常规技术。 STR基因座应用于某一特定地区人群或某一特定种族之前，首先要建立稳定、可靠、重复性良好的分型方法;其次是必须进行群体遗传学调查研究，从而获得基因频率和法医学应用参数，评估其在法医学中的应用价值。目前最常使用的STR基因座主要来自遗传学数据库(Genetic Databank，GDB，)，而GDB中大多数基因座尚未进行群体调查，且大部分STR基因座，在河南汉族人群中，尚无群体遗传学资料和法医学应用数据，急待研究，以备以后检案和建立DNA数据库应用。 目的： 系统研究TPOX、TH01、D19S253、D12S391、D7S820、D10S1213、D8S1132和D1S549等，8个STR基因座及mtDNA(CA)n重复子，在河南汉族群体中的遗传多态性，获取8个STR基因座及mtDNA(CA)n重复子，在河南汉族人群的群体遗传学数据和法医学应用参数，并针对法医学现场检材的特殊情况，探索多种条件下疑难检材DNA提取的有效方法，探讨其在河南汉族人群中的法医学应用价值，为法医DNA分型提供新的候选STR遗传标记。主要包括: 1.用chelex-100法提取214份河南汉族无血缘关系个体的外周静脉血DNA; 2.对比评价几种DNA提取方法对疑难检材，包括腐败肌肉、骨骼、现场严重污染的血痕、现场严重污染的精斑(或混合斑)、指(趾)甲和毛干DNA的提取效果，建立新的疑难检材的DNA提取方法; 3.8个STR基因座及mtDNA(CA)n重复子，在河南汉族群体的214名个体中进行频率调查，获得8个STR基因座及mtDNA(CA)n重复子，在河南汉族人群的群体遗传学数据和法医学应用参数; 4.对8个STR基因座及mtDNA(CA)n重复子，在河南汉族人群中的法医学应用价值进行评估; 5.对所建立的新的疑难检材DNA的提取方法进行评价。 方法： 1.不同现场条件检材的收集 第一组:214名无血缘关系个体均来自河南汉族群体，遵照知情同意原则，采集其静脉血，EDTA抗凝，-20℃保存; 第二组:各种现场条件的疑难检材89份，包括腐败肌肉16份、骨骼8份、现场严重污染的血痕35份、现场严重污染的精斑(或混合斑)10份、指(趾)甲10份和毛干10份。 2.DNA提取 第一组:214名河南汉族无血缘关系个体的新鲜血，用Chelex-100法提取DNA; 第二组:疑难检材，根据各种生物学检材的种类、特性和被污染的情况，建立了适合各种疑难检材核及线粒体基因组DNA的提取方法，对条件差的混合斑，采用本课题所建立的差异消化法——二氧化硅膜纯化方法提取DNA。 3.8个STR基因座的群体遗传学研究 从GDB数据库中查出8个STR基因座及mtDNA(CA)n重复子，按数据库提供的序列合成引物，经PCR扩增、聚丙烯酰胺凝胶电泳(Polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE)和硝酸银染色技术检测，对214名河南汉族无血缘关系个体的8个STR基因座及mtDNA(CA)n重复子进行DNA分型，对分型结果进行统计学分析，获得各基因座基因频率及法医遗传多态性数据。 4.疑难生物学检材的分型检测 按8个STR基因座扩增和分型检测的方法，对89份疑难生物学检材不同方法提取的DNA样本分别进行分型检测，并比较不同方法提取DNA的分型结果和检测效果。 5.同步分型技术的建立及应用 根据8个STR基因座在河南汉族群体中的群体遗传学研究结果、文献报道的基因座参数，以及基因座的检测条件，建立多个STR座位(16～24个)同步分型技术。 结果： 1.对214例河南汉族无血缘关系个体的分型结果，进行遗传学分析和统计学数据处理，获得了TPOX、TH01、D19S253、D12S391、D7S820、D1S549、D10S1213、D8S1132，共8个STR基因座和mtDNA(CA)n重复子的基因频率、观察杂合度、个人识别率、非父排除率和多态性信息含量等，群体遗传数据及法医学应用参数。 2.8个基因座相互不在同一条染色体上，均为四核苷酸重复序列，只观察到TH01的9.3不完整重复单位等位基因，PCR扩增重复性好，扩增片段在300bp以下。除TPOX、TH01外，均有8～11个等位基因，除TPOX、D10S1213外，其他6个基因座基因频率分布良好，有5～7个常见基因，除TPOX、TH01、D10S1213外，其他5个基因座杂合度大于0.7，个人识别能力大于0.9，属于高杂合度、高多态性基因座，符合STR基因座的选择标准，。联合检测8个基因座，累计个人识别能力高达0.999999997，三联体非父排除率0.9985，二联体非父排出率0.9782，适用于法医学亲权鉴定和个人识别。mtDNA(CA)n重复子，在214例河南汉族个体检出4种等位基因，重复5～8次，以基因5和6为主，频率分别为0.4065和0.5794，基因差异度(GD)0.5013。 3.应用所建立的疑难检材核和线粒体DNA提取方法，和二氧化硅膜纯化方法，成功提取89份疑难生物学检材DNA模板，并在8个STR基因座和mtDNA(CA)n重复子获得理想的分型结果。16份腐败肌肉用Chelex-100快速法提取DNA，经多座位同步扩增，电泳检测，证实无扩增产物，分型失败，改用本课题建立的DNA提取及纯化方法处理检材，11份分型成功，5份失败。8份骨骼中，7份分型成功，只有1份埋在土壤9年的骨骼分型失败。35份严重污染血痕和10份严重污染的精斑(或混合斑)，血痕用Chelex-100快速法提取DNA，精斑(或混合斑)用传统的差异消化酚/氯仿法，提取DNA分型失败，改用本课题上述建立的DNA提取及纯化方法，处理检材分型成功。10份指(趾)甲和10份毛干用Chelex-100法提取DNA，不能有效的破坏角蛋白成分，得不到足够的模板DNA。用本课题建立的方法提取DNA，得到了足够的DNA模板，使毛干和指甲获得了理想的分型结果。 4.根据8个STR基因座在河南汉族群体中的群体遗传学研究结果、结合文献报道的基因座参数，以及基因座的检测条件，建立了多个STR座位(16～24个)同步分型技术，并成功用于司法鉴定检案400余例。 结论： 1.河南汉族人群中，TPOX、TH01、D19S253、D12S391、D7S820、D1S549、D10S1213、D8S1132等8个STR基因座，均属于高度多态性遗传标记，容易得到准确分型，具有很高的法医学应用价值，可作为法医学个人识别和亲权鉴定新的候选遗传标记。 2.应用所建立的疑难检材核和线粒体DNA提取方法和二氧化硅膜纯化方法，可以较好地解决现场疑难生物学检材的STR基因座分型。 3.mtDNA(CA)n重复子，在腐败或角化等疑难生物学检材的检验鉴定中，有较高的应用价值，在母系亲权鉴定中具有一定的优势。
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