摘要
背景: 随着电离辐射的日益广泛应用，开发低毒高效的辐射防护剂迫在眉睫。近年来，NF-κB逐渐成为辐射防护领域的研究热点，对其激活可诱发细胞多种促存活事件，对正常组织产生辐射防护作用。然而，激活NF-κB还可引发炎症因子爆发、肿瘤细胞能量代谢改变等诸多反应。因此，如何驾驭NF-κB使其发挥对正常组织的辐射防护作用，避免其副作用，增强肿瘤放疗效果，引起了我们的研究兴趣。研究表明，通过TLRs受体激活NF-κB可以很好地实现这一目的。因此，本课题第一部分围绕新型TLR4激动剂MPLA对小鼠多器官辐射损伤防护效应及机制展开了研究。此外，还针对MPLA对肿瘤细胞放射敏感性的影响进行了检验。在第二部分中，则主要围绕IR对癌细胞NF-κB相关代谢关键酶ACSL家族的影响、Acsl6在调节肿瘤放疗敏感性方面的重要作用及其分子机制、MPLA联合敲除Acsl6基因提高肿瘤细胞放射敏感性等几个方面展开了深入研究。 目的: 1.明确MPLA体内外辐射防护效应 2.探索MPLA辐射防护作用的分子机制 3.检测MPLA对肿瘤细胞放射敏感性的影响 4.对癌细胞照后不同ACSL同工酶转录水平变化进行筛选 5.验证Acsl6敲除提高肿瘤细胞放射敏感性的作用 6.探究Acsl6敲除放射增敏机制 7.初步验证MPLA联合ACSL6敲除可提高肿瘤放疗效果。 方法: 1.细胞培养与处理:采用HUVEC，L02，RAW264.7，LLC和RM9细胞。MPLA给药实验于IR前12小时加药（1μg/ml用DMSO溶解），对照组给予相应剂量DMSO。 2.实验动物:动物实验采用6-8周龄的野生型C57BL/6小鼠，TLR4(-/-)小鼠以及TRIF突变型小鼠(TRIFmutant)。MPLA给药以生理盐水溶解，剂量为1μg/mouse，0.1ml/mouse，方式为灌胃强饲，时间为IR前12h。 3.γ射线照射:第一部分采用海军军医大学辐照中心Co60-γ射线照射源;第二部分采用美国德州大学西南医学中心放射肿瘤学部分子放射生物学系137Cs-γ射线照射源。 4.细胞活力检测:采用CCK-8法检测细胞活力。 5.凋亡检测:采用AnnexinⅤ/PI双染法以流式细胞术检测细胞凋亡。 6.细胞周期检测:应用PI单染法检测，FlowJo软件分析。 7.动物取材:照后不同时间点处死小鼠，分离组织，制作单细胞悬液。 8.彗星电泳实验:采用玻片双层凝胶法以中性细胞电泳进行。 21.统计分析:应用Excel、SPSS21对数据进行统计分析，以GraphPad Prism6、SigmaPlot13.0进行绘图。两组间比较用两独立样本的t检验进行，P值小于0.05认为其具有统计学意义。 结果: 一、MPLA辐射防护作用及机制研究 1.MPLA可以有效减轻IR所致细胞凋亡，促进细胞照后DNA损伤修复 凋亡检测发现MPLA显著降低了IR引起的细胞凋亡;而细胞周期检测显示MPLA有效降低了IR导致的G2/M期周期阻滞;彗星电泳实验显示MPLA有效减少了IR所致细胞核拖尾程度，且OTM和TM值均显著降低。 2.MPLA对照后小鼠体内造血系统的辐射防护作用 IR引起了小鼠骨髓空虚化且损伤程度呈进行性加重，骨髓有核细胞计数于照后第三天显著降低，而MPLA明显改善了这些损伤情况。同时，MPLA提高了照后小鼠B220-且CD34+骨髓细胞的比例。 3.MPLA对小鼠脾脏具有TLR4依赖的辐射防护作用 IR引起了小鼠脾脏白髓面积、数目明显缩小，而MPLA能够有效增加其白髓范围;脾细胞凋亡检测结果显示，MPLA能够明显降低辐射引发的脾细胞凋亡率，并且有效扭转了IR引发的脾细胞CD4+/CD8+比例失调。然而，这些MPLA对脾脏的辐射防护效果并未出现在TLR4-/-小鼠中，说明了该效应依赖TLR4而发挥。 4.MPLA可减轻小鼠的睾丸、小肠辐射损伤，提高照后动物生存率 MPLA显著改善了睾丸、小肠的组织学辐射损伤;且有效提高了不同致死剂量、不同照射方式下的动物生存率。 5.MPLA的辐射防护作用依赖于TLR4 以TLR4-/-小鼠为研究对象，发现MPLA未能扭转IR对骨髓、脾脏等造成的组织学损伤，不能改善骨髓有核细胞、脾细胞等的辐射损伤，说明MPLA的辐射防护作用依赖于TLR4受体而发挥。 6.MPLA激活TLR4后启动MAPK信号通路(p38途径）并且提高了NF-kB p65核转位及其转录活性 通过WB实验，发现MPLA促进了IKK-β的磷酸化，而免疫荧光实验显示MPLA诱导了明显的NF-κB p65核转位，与此同时，荧光素酶检测提示MPLA显著提高了细胞内NF-κB转录水平。 7.MPLA主要通过Myd88介导TLR4信号通路转导 以RAW264.7为研究对象，通过siRNA分别敲低TRIF以及Myd88基因，检测细胞凋亡。MPLA显著降低了IR引起的WT及TRIF KD细胞的凋亡率，而对Myd88KD细胞无保护作用。此外，通过对TRIFmutant小鼠组织学检测发现，MPLA仅部分改善了IR造成的骨髓细胞缺失，而对脾脏组织结构损伤无影响。 8.MPLA可改善IR引起的高炎性状态以及Th1/Th2免疫失衡 以ELISA法检测不同处理组小鼠血清细胞因子含量。结果显示，MPLA+IR组中IL-6及TNF-α水平相对于IR组显著降低;进一步研究发现，MPLA能够改善IR造成的小鼠Th1/Th2免疫失衡。 9.MPLA对LLC、RM9辐射敏感性的影响 以LLC、RM9为研究对象，通过平板克隆形成实验检测MPLA对癌细胞辐射敏感性的影响。结果显示，MPLA均未增加两种肿瘤细胞辐射抗性。 二、ACSL6对肿瘤细胞放射敏感性的影响及其分子机制研究 1.ACSL系列同工酶对肿瘤细胞放射生物学反应的影响筛选 通过qRT-PCR的手段分别对LLC及RM9IR之后ACSL五种同工酶基因转录水平进行检测，发现只有Acsl6基因在IR之后48h显著上调;对于LLC，IR之后24h即出现了Acsl6的明显增高。 2.构建Acsl6敲除细胞系 利用CRISPR Cas9技术对LLC、RM9细胞成功进行了Acsl6基因的敲除以及稳定敲除细胞株的筛选。 3.Acsl6KO显著降低了肿瘤细胞IR之后克隆形成能力 以LLC、LLC KO1、LLC KO3、RM9以及RM9KO为研究对象，行克隆形成实验检测细胞的放射敏感性变化。结果显示，所有基因敲除组细胞克隆形成能力明显降低。 4.Acsl6KO参与LLC细胞Warburg效应的调节 利用比色法检测了细胞外L-乳酸含量，以反映细胞的有氧糖酵解水平。实验结果显示，将Acsl6敲除之后，LLC在IR之后2h、24h的乳酸水平显著降低。然而，RM9细胞并未出现此现象。 5.Acsl6KO活化了LLC中能量代谢调控因子AMPK，但对RM9未产生明显影响 AMPK可以负向调节Warburg效应，二者之间存在着紧密联系。以WB实验检测AMPK在各细胞株的磷酸化情况，发现在未照射或者10Gy照后，LLC KO1细胞在24h、48h时AMPKα磷酸化水平都显著上调，而此现象未出现在RM9细胞中。 6.Acsl6KO增加了γ-H2AX焦点的形成 以LLC、LLC KO1、RM9、RM9KO等细胞株为研究对象，行γ-H2AX免疫荧光实验。Acsl6敲除后使LLC、RM9核内γ-H2AX焦点数目都显著增加，反映了其DNA损伤修复能力的降低。 7.Acsl6KO通过AMPK-P53通路提高癌细胞内P53磷酸化水平及总P53浓度 WB结果显示，Acsl6敲除后显著提高了LLC、RM9内P53磷酸化水平。IR提高了LLC中P53磷酸化水平，而敲除组细胞中升高更为明显，P53总量也显著上升;升高的磷酸化P53均可被ATM抑制剂KU-55933所阻断，而后者反而增加了AMPK的磷酸化水平。 结论: 基于激活NF-κB而发挥辐射防护作用的TLRs激动剂在放射生物学领域已经得到了广泛重视，同时也是本室长期关注、重点研究的课题之一。本课题分为两个部分，分别对MPLA辐射防护作用及ACSL6敲除放射增敏进行了研究: 第一部分中，首次发现并证实了新型TLR4激动剂MPLA能够有效发挥多器官低毒高效的辐射防护作用，并且较为明晰地揭示了其所依赖的“TLR4-Myd88-MAPK(p38)-NF-κB-纠正TH1/Th2、炎症因子调节”信号通路。此外，初步证明了MPLA直接作用于癌细胞不增加其辐射抗性。 第二部分中，首次发现了IR能够诱发癌细胞Acsl6基因转录特异性上调;而敲除该基因之后，显著增加了癌细胞的放射敏感性;进一步研究发现，ACSL6调控癌细胞放射敏感性机制与Warburg效应、ROS、自噬、G1阻滞及DNA损伤修复通路等紧密相关;并且，MPLA联合敲除ACSL6基因提高肿瘤放疗效果展现了良好的前景，提供了诸多新型分子靶点。
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