摘要
目的： 冷水束缚应激（Water immersion restraint stress，WIRS）因为其良好的可重复性和临床相关性，被广泛应用于应激诱导急性胃黏膜损伤的实验模型。因此，本课题采用冷水束缚应激诱导大鼠急性胃黏膜损伤模型，初步探讨: 1.冷水束缚应激对支配大鼠胃组织相应阶段背根神经节(T8-11)、胃组织和胃黏膜中TRPA1和P物质表达的影响，观察TRPA1和P物质对急性胃黏膜损伤的作用并探讨可能的机制。 2.大鼠鞘内、腹腔注射TRPA1特异性拮抗剂HC-030031和口服TRPA1特异性激动剂异硫氰酸烯丙酯(Allyl isothiocyanate，AITC)，进一步观察TRPA1和P物质对急性胃黏膜损伤的影响并探讨可能的机制，以及TRPA1对P物质释放的影响。 方法： 雄性Wistar大鼠(weight180-220g，6-8weeks old)，随机分为6组，空白对照组(Control group)，大鼠未经过任何处理;冷水束缚应激模型组(WIRS group)，大鼠在自制的鼠笼内冷水(16±1℃)浸泡6h，水位平大鼠剑突;鞘内注射HC-030031组(ITIH group)，大鼠冷水束缚应激前30min鞘内注射HC-03003110μl(10μg/μl，HC-030031溶解在二甲基亚砜);腹腔注射HC-030031组(IPIH group)，大鼠冷水束缚应激前1h腹腔注射HC-030031(150mg/kg，HC-030031溶解在0.5％甲基纤维素)。冷水束缚应激6h后，取大鼠的背根神经节(T8-11)、胃组织和胃黏膜。AITC组，口服AITC17mg/kg(AITC溶解在含有3％乙醇和10％吐温的生理盐水中），AITC对照组口服不含有AITC的溶液，2h后，取大鼠的背根神经节(T8-11)、胃组织和胃黏膜，应用苏木素-伊红染色(Hematoxylin and eosin stain，HE)或戊二醛、四氧化锇酸固定及一系列处理胃组织后，分别应用光学显微镜(Optical Microscope，OM)和透射电子显微镜(Transmission electron microscopy,TEM)观察各组大鼠胃黏膜和胃黏膜细胞的损伤情况。应用实时荧光定量聚合酶链式反应(RT-PCR)、蛋白免疫印迹法(Western blot)、免疫组织化学(IHC)分别检测背根神经节和胃组织中TRPA1和P物质基因水平和蛋白水平表达的变化。应用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测胃黏膜中P物质浓度的变化。 结果： 1.光学显微镜观察各组大鼠胃组织HE染色胃黏膜损伤情况显示，未经处理的Control组:胃黏膜结构正常，层次清楚，上皮完整，上皮层细胞排列紧密、规则，未见坏死脱落;间质无水肿及红细胞渗出和炎症细胞浸润;固有层腺体排列整齐、密集，未见萎缩和缺失;黏膜下层也未见肿胀及毛细血管出血倾向和瘀血扩张。WIRS组:胃黏膜片状脱落，多发浅表溃疡，有时可见火山口样巨大溃疡。可见大量急性糜烂性出血性坏死灶;黏膜层广泛的上皮细胞弥漫性凝固坏死脱落，同时伴有广泛的红细胞渗出和炎性细胞浸润，毛细血管出血及瘀血扩张;固有层腺体结构紊乱、萎缩明显，数量减少甚至缺失;细胞间质变大水肿;黏膜下层结构疏松水肿、血管淤血扩张。与Control组比较，WIRS组胃黏膜损伤评分明显提高(P＜0.001)。ITIH组或IPIH组:胃黏膜完整性较好，受损黏膜较表浅局限，仅有轻度充血、水肿，偶见炎性细胞浸润;表层上皮有少部分坏死、脱落;局部腺体结构紊乱。与WIRS组比较，ITIH组或IPIH组胃黏膜损伤评分明显降低(P＜0.001)。AITC组:可见胃黏膜受损，上皮细胞坏死脱落;黏膜层水肿，可见红细胞渗出和毛细血管出血;偶见黏膜下层结构疏松水肿和血管淤血扩张。与Control比较，AITC组胃黏膜损伤评分明显提高(P＜0.001)。 2.TEM观察各组大鼠胃黏膜细胞损伤情况显示，未经处理的Control组:胃组织上皮细胞完整;线粒体、粗面内质网和细胞核结构正常。WIRS组:胃组织上皮细胞变性;广泛存在主细胞和/或壁细胞的细胞核受损、核周间隙增宽;线粒体受损严重，有些完全失去正常结构，轮廓模糊、线粒体嵴减少或消失;粗面内质网扩张甚至空泡变性;紧密连接松散;有些分泌小管极度扩张。与Control比较，胃黏膜细胞损伤评分明显提高(P＜0.001)。ITIH组或IPIH组:局部可见线粒体损伤，但线粒体嵴和轮廓存在;粗面内质网局部扩张，空泡变性基本消失;紧密连接结构正常;未见分泌小管扩张。与WIRS组比较，ITIH组或IPIH组胃黏膜细胞损伤评分明显降低(P＜0.001)。AITC组:可见胃组织的主细胞和/或壁细胞核受损、周间隙增宽;可见线粒体损伤，多伴有线粒体嵴减少或消失，但轮廓存在;粗面内质网局部扩张，偶发空泡变性;偶见分泌小管扩张。与Control组比较，AITC组胃黏膜细胞损伤评分明显提高(P＜0.001)。 3.同Control组比较，WIRS组大鼠背根神经节(T8-11)和胃组织中TRPA1和P物质基因水平和蛋白水平表达上调、胃黏膜中P物质释放增加(P＜0.001)。 4.同WIRS组比较，鞘内或腹腔注射TRPA1的特异性拮抗剂HC-03003(1ITIH组或IPIH组)，有效减轻WIRS诱导的大鼠急性胃黏膜损伤和抑制背根神经节(T8-11)、胃组织和胃黏膜中P物质释放(P＜0.001)。 5.同Control组比较，口服TRPA1特异性激动剂AITC，诱导大鼠胃黏膜中度损伤，大鼠背根神经节(T8-11)、胃组织和胃黏膜中P物质的释放明显增加(P＜0.001)。 结论： 1.冷水束缚应激诱导大鼠急性胃黏膜损伤，使背根神经节(T8-11)和胃组织中TRPA1和P物质的表达上调、胃黏膜中P物质的释放增加。应激诱导的急性胃黏膜损伤与TRPA1和P物质的激活密切相关，其机制可能是二者的激活引起神经元性和非神经源性炎症以及内脏痛觉过敏。 2.TRPA1拮抗剂HC-030031明显改善冷水束缚应激引起的大鼠急性胃黏膜损伤，其机制可能是HC-030031显著抑制TRPA1的表达和P物质在背根神经节、胃组织和胃黏膜中的释放，减轻其在胃组织引起的神经源性和非神经源性炎症及内脏痛觉过敏。 3.TRPA1激动剂AITC，诱导大鼠胃黏膜中度损伤和P物质在大鼠背根神经节(T8-11)、胃组织和胃黏膜中的释放明显增加。 4.在应激诱导的AGML的大鼠模型中，P物质的释放主要由TRPA1调控。
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