摘要
目的：通过研究组方对MA、A、HA体外溶出率、体外吸收、大鼠体内动态变化及相应药理效应改变（即PK-PD）的影响，分析臣药干姜，佐药甘草在君药附子效应成分及对心肌细胞损伤保护中的作用，阐明四逆汤(SND)的组方原理，为方剂配伍规律的研究提供方法学参考，丰富方剂配伍规律研究的内容。 方法：(1)四逆汤组方原理的体外化学研究:①采用正交试验设计考察四逆汤各拆方组（附子组、附姜组、附草组、全方组）的最佳喷雾干燥工艺并制备各拆方组喷雾干燥粉。②采用HPLC法，色谱柱为Magic C18AQ（常量柱，3μ200A，0.2mm×50mm），乙腈-水（含0.1％三乙胺）进行梯度洗脱(0～5min，20％～65％，5～7min，95％，7～9min，20％)，流速1.0mL·min-1，紫外检测波长237nm.，定量检测四逆汤各拆方组中的新乌头碱、乌头碱、次乌头碱，从体外化学角度研究四逆汤的组方原理。 (2)四逆汤组方原理的体外吸收研究:①体外培养人结肠癌细胞，建立Caco-2细胞模型，并进行各项指标评价;②采用HPLC法，色谱柱为Magic C18AQ(微量柱连接Trap柱，5μ200A，0.3mm×50mm)，乙腈-水（含0.1％三乙胺）进行梯度洗脱(0～15min，20％～80％，15～18min，95％，18～25min，20％)，流速25μL·min-1，紫外检测波长237nm，定量检测四逆汤各拆方组加至肠腔侧（AP侧）经肠吸收120min后基底侧(BL侧)的新乌头碱、乌头碱、次乌头碱，从肠吸收角度阐明四逆汤药味配伍的规律。 (3)四逆汤组方原理的PK-PD研究:①建立血液微透析方法，测定各探针体内外回收率;将探针通过左右两侧股静脉埋入下腔静脉，连续收集四逆汤各拆方组经大鼠口服后0～6h的血透析液;②采用RP-HPLC法的微量柱(Nano-column)连接富集柱(Trap)以梯度洗脱方式定量检测四逆汤各拆方组经大鼠口服后0～6h血透析液中的新乌头碱、乌头碱、次乌头碱;将同步收集的透析液用于体外培养H2O2引起损伤的心肌细胞模型中，观察其保护作用;将各拆方组0～6h3种乌头碱成分AUC0～6h分别与各组心肌细胞上清液中LDH和细胞内MDA含量的相关性进行分析，从药动-药效角度阐明四逆汤药味配伍的规律。 结果：(1)四逆汤组方原理的体外化学研究:①采用喷雾干燥法可制备得粉率高、含水量低、吸湿性小的四逆汤各拆方组喷雾干燥粉，最佳工艺条件为:浸膏相对密度1.10，进风温度160℃，雾化压力500L·h-1，流速2.8mL·min-1。②3种乌头碱的线性范围分别为新乌头碱(6.65～665μg·mL-1)、乌头碱(6.05～605μg·mL-1)、次乌头碱(5.80～580μg·mL-1);日内和日间精密度RSD％分别为新乌头碱(0.58％，0.7％)、乌头碱(0.58％，1.13％)、次乌头碱(0.98％，1.69％);平均回收率及RSD％分别为新乌头碱(98.77％，0.41％)、乌头碱(101.3％，1.55％)、次乌头碱(97.48％，1.34％)。与附子相比，附子+干姜配伍可使新乌头碱含量降低51.32％，乌头碱含量升高75.59％，次乌头碱含量升高85.89％，总乌头碱含量增加79.14％;附子+甘草配伍可使新乌头碱含量升高14.29％，乌头碱含量升高170.4％，次乌头碱含量升高2497.28％，总乌头碱含量增加310.32％;附子+干姜+甘草配伍可使新乌头碱含量降低35.10％，乌头碱含量升高445.17％，次乌头碱含量升高2751.70％，总乌头碱含量增加482.01％。 (2)四逆汤组方原理的体外吸收研究:①接种于Transwell细胞转运培养槽聚碳酯微孔滤膜上的Caco-2细胞，在37℃和5％CO2浓度培养条件下培养21d，细胞跨膜电阻值高于620Ω·cm2;甘露醇透过率低于0.3％·h-1·cm-2;肠腔侧(AP)碱性磷酸酶活性显著高于基底侧(BL)酶活性。表明在本实验室构建的Caco-2细胞模型在形态上与小肠上皮细胞相似，细胞已产生极性，且细胞间已形成紧密连接，可作为小肠吸收的体外模型。②3种乌头碱的线性范围分别为新乌头碱（0.27～135μg·mL-1）、乌头碱(0.31～153μg·mL-1)、次乌头碱(0.28～140μg·mL-1);日内和日间精密度RSD％分别为新乌头碱(2.83％，3.31％)、乌头碱(1.39％，1.91％)、次乌头碱(2.12％，3.73％);平均回收率及RSD％分别为新乌头碱(88.90％，2.05％)、乌头碱(90.99％，1.13％)、次乌头碱(87.82％，2.26％)。与附子相比，附子+干姜配可使新乌头碱吸收减少77.20％，乌头碱吸收减少38.76％，次乌头碱吸收减少35.72％，总乌头碱吸收减少49.14％;附子+甘草配伍可使新乌头碱吸收减少83.06％，乌头碱吸收增加17.67％，次乌头碱吸收减少311.68％，总乌头碱吸收减少9.72％;附子+干姜+甘草配伍可使新乌头碱吸收减少95.30％，乌头碱吸收增加37.01％，次乌头碱吸收减少533.47％，总乌头碱吸收增加12.79％。 (3)四逆汤组方原理的PK-PD研究:①探针的体内外平均回收率分别为新乌头碱(55.65±0.77％，66.70±0.88％)、乌头碱(55.51±0.85％，66.38±1.17％)和次乌头碱(56.12±0.84％，67.52±0.95％)。②与附子相比，附子+干姜配可使3种乌头碱成分AUC0～6h降低40.85％，附子+甘草配伍可使3种乌头碱成分AUC0～6h增加8.42％，附子+干姜+甘草配伍可使3种乌头碱成分AUC0～6h增加28.84％;在0～6h之间，四逆汤各拆方组中3种乌头碱成分AUC0～6h与心肌LDH及MDA含量降低之间均存在一定的相关性，回归方程为:Y=0.0099X-0.1505(r=0.9004)，Y=0.0157X-0.1230(r=0.9709)。 结论：(1)体外化学研究表明，附子+干姜、附子+甘草、附子+干姜+甘草配伍均可使3种乌头碱含量显著增加，且附子+干姜+甘草配伍增加更显著。表明四逆汤中干姜和甘草配伍有利于3种乌头碱的溶出。 (2)体外吸收研究表明，附子+干姜、附子+甘草配伍后3种主要乌头碱成分的吸收呈下降趋势，但附子+干姜+甘草配伍后3种主要乌头碱成分的吸收有所增加。表明虽然配伍可使体外溶出显著增加，但由于吸收过程中发生相互作用，使可能产生毒性的3种主要乌头碱成分的吸收减少，从而体现了四逆汤配伍解毒的组方原理。 (3)PK-PD研究表明，附子+干姜配伍后3种乌头碱成分在大鼠体内吸收呈下降趋势，但附子+甘草、附子+干姜+甘草配伍后3种乌头碱成分在大鼠体内吸收略有增加，且附子+干姜+甘草配伍后能更有效地保护H2O2引起的心肌损伤，从而体现了四逆汤配伍增效的组方原理。 方剂组方原理的研究是一个庞大的系统工程，应充分利用化学、生物学、药理学、中医学、数理统计学、计算机科学等多学科交叉优势。有重点、有顺序地从多角度、多环节进行研究。同时也必须认识到这一过程需要很长的时间，需要很多人的共同努力和不断尝试。但是，随着科学技术的发展，相信更多相关边缘学科的产生将逐步揭开复方配伍的奥秘所在。
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