摘要
本文分为以下几个部分进行探讨： 第一部分 AF1q在结直肠癌中的表达及其作用研究 目的： 研究AF1q在结直肠癌细胞系及肿瘤组织中的表达情况，探讨AF1q的表达与结直肠癌发生的相关性。 方法： 1.通过RT-PCR、免疫组化方法比较AF1q在结直肠癌组织及癌旁组织中的表达情况及其与临床病理资料的关系。 2.利用癌症基因组图谱在线数据库（The Cancer Genome Atlas, TCGA）进行生存分析,探讨AF1q与结直肠肿瘤的预后关系。 3.通过RT-PCR及Western Blot方法比较AF1q在不同结直肠癌细胞系中的表达情况； 结果： 1. AF1q基因mRNA表达水平以及蛋白质表达水平，在结直肠癌组织中均明显高于对照癌旁组织。回归分析显示，AF1q的表达水平与结直肠癌的淋巴结转移、TNM分期密切相关。 2.利用 TCGA数据库结果进行生存分析提示，无论是总生存率（OS， overall survival）还是无疾病生存率（DFS， disease free survival），AF1q高表达组均显著差于AF1q低表达组。 3. AF1q在结直肠癌细胞系(SW480, SW48, KM12, SW620, and LoVo)中的表达高于对照正常肠上皮细胞系(NCM460)。在SW620、LoVo细胞系中高表达，在SW48、SW480细胞系中低表达。 结论： AF1q的表达水平与结直肠癌患者的淋巴结转移情况、TNM分期、以及预后情况密切相关。AF1q在结直肠癌细胞系中的表达水平高于正常肠上皮细胞系。 第二部分 AF1q对结直肠癌细胞增殖、凋亡、以及侵袭转移的影响 目的： 研究结直肠癌细胞系中AF1q对肿瘤细胞增殖、凋亡、侵袭转移能力的影响。 方法： 1.在 AF1q本底表达较高的 SW620、LoVo细胞系中构建 AF1q稳定低表达的SW620-shAF1q、LoVo-shAF1q细胞系；在AF1q本底表达较低的SW48、SW620细胞系中构建AF1q稳定高表达的SW48-AF1q、SW480-AF1q细胞系。并用Western Blot方法检测构建的稳转细胞系中AF1q的表达情况。 2.采用CCK-8试剂盒以及克隆形成实验检测AF1q高表达或低表达对肿瘤细胞增殖的影响；采用Annexin V试剂盒检测AF1q高表达或低表达对肿瘤细胞凋亡的影响； 3.采用划痕实验、Transwell实验检测AF1q高表达或低表达对肿瘤细胞侵袭转移的影响；并通过动物实验验证上述结论； 结果： 1.成功构建了AF1q高表达及低表达的SW620-shAF1q、LoVo-shAF1q、SW48-AF1q、SW480-AF1q细胞系。 2.细胞增殖实验表明：在SW620、LOVO细胞中低表达AF1q能抑制肿瘤细胞生长；在SW48、SW480细胞中高表达AF1q能促进肿瘤细胞生长。 细胞凋亡实验表明：在SW620、LOVO细胞中低表达AF1q能促进肿瘤细胞凋亡。在SW48、SW480细胞中高表达AF1q能抑制肿瘤细胞发生凋亡。 克隆形成实验表明：AF1q高表达后，肿瘤细胞的克隆形成能力明显增强与对照组。AF1q低表达后，肿瘤细胞的克隆形成能力明显低与对照组 细胞划痕实验表明：在SW620细胞中低表达AF1q后，肿瘤细胞迁移能力减弱。在SW48细胞中高表达AF1q后，肿瘤细胞的迁移能力增强。 Transwell实验表明：在SW620细胞中低表达AF1q后，肿瘤细胞的迁移能力、侵袭能力均减弱。在SW48细胞中高表达AF1q后，肿瘤细胞的迁移能力、侵袭能力均增强。 裸鼠皮下成瘤实验：与对照组相比较，AF1q低表达后，SW620细胞形成的肿瘤体积较对照组要小、肿瘤生长速度较慢、形成的肿瘤重量较轻。 裸鼠肝转移模型：5只裸鼠脾脏包膜下注入2×106AF1q低表达的SW620/AF1q-shRNA细胞；5只裸鼠脾脏包膜下注入2×106对照的SW620/nc-shRNA细胞。40%（2/5）裸鼠可检出肉眼可见肝转移灶。80%（4/5）裸鼠可检出肉眼可见肝转移灶。与对照组相比，SW620/AF1q-shRNA肝转移灶的数量较少。 结论： AF1q高表达能促进肿瘤细胞增殖、抑制细胞凋亡、促进肿瘤的迁移能力、侵袭转移能力。细胞实验及动物实验均证实，AF1q低表达能抑制肿瘤增殖、促进细胞凋亡、抑制肿瘤的迁移能力、侵袭转移能力。 第三部分 AF1q在结直肠癌中发挥作用的机制研究 目的：探讨AF1q的作用机制和AF1q与EMT、AKT信号通路之间的关系。 方法： 1.通过Western Blot方法研究AF1q对肿瘤细胞EMT的影响： 2.探讨AF1q对AKT信号通路的影响； 3.利用选择性的AKT磷酸化抑制剂SH-6，进一步明确在AF1q是通过影响AKT磷酸化而发挥作用。 结果： 1. AF1q能影响肿瘤细胞的EMT过程。 AF1q低表达后，上皮细胞标志物α-catenin、 E-cadherin表达增高，而间质细胞标志物 N-cadherin、ZO-1表达降低。 而Af1q高表达后，上皮细胞标志物α-catenin、 E-cadherin表达降低，而间质细胞标志物 N-cadherin、ZO-1表达增高。结果证实， AF1q发挥作用的过程中，发生了EMT表型变化。 2. AF1q是通过影响AKT磷酸化而发挥作用。 AF1q低表达对总AKT（total AKT, tAKT），丝氨酸473位AKT磷酸化（AKT phosphorylated at serine473, pAKT-473）变化影响不大，而苏氨酸308位AKT磷酸化（AKT phosphorylated at threonine308, pAKT-308）表达明显降低。 AF1q高表达后，tAKT与pAKT-473变化影响不大，而pAKT-308表达明显增高。 3.抑制AKT的磷酸化能逆转AF1q的功能：AF1q高表达的SW48/AF1q细胞与SH-6共培养后，由于AKT磷酸化被抑制，增殖能力被逆转； 通过划痕实验证实，随着AKT磷酸化被抑制，SW48细胞高表达AF1q后，增强的迁移能力逆转。Transwell实验同样证实，随着AKT磷酸化被抑制，SW48细胞高表达AF1q后，增强的迁移、侵袭能力被SH-6逆转 在高表达AF1q的SW48/AF1q细胞中加入AKT抑制剂，结果发现：α-catenin、E-cadherin表达增高，间质细胞标志物 N-cadherin、ZO-1表达降低 结论：AF1q通过影响AKT的磷酸化，导致了EMT的发生，并影响肿瘤细胞的增殖、侵袭转移。磷酸化位点作用于苏氨酸308位，而对总AKT、丝氨酸473位的磷酸化影响不大。抑制AKT的磷酸化能逆转AF1q的功能。
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