摘要
本文分为以下几个部分: 第一部分:以Chk1为靶点在胃癌治疗中价值的评估 目的：研究细胞周期检查点蛋白Chk1在胃癌细胞中的功能，并评估Chk1抑制剂LY2606368在胃癌细胞中的抗肿瘤作用。 方法：为了研究Chk1在胃癌细胞中的功能，设计了Chk1特异性siRNA敲低p53野生型细胞系AGS及p53突变型细胞系MKN1中Chk1表达，使用MTS法评估Chk1对胃癌细胞增殖的影响，检测了Chk1敲低在胃癌中细胞中对电离辐射敏感性的影响。此外，用MTS法及平板克隆实验检测了Chk1抑制剂LY2606368在胃癌细胞系AGS及MKN1中抗肿瘤效果，运用Western blot检测了LY2606368处理胃癌细胞后，其DNA损伤，凋亡相关标志表达水平的变化。 结果：MTS的结果表明使用siRNA敲低Chk1后，胃癌细胞系AGS,MKN1的增殖能力明显减低，对电离辐射的敏感性明显增强。使用Chk1抑制剂处理LY2606368处理胃癌细胞AGS及MKN1后，能明显抑制肿瘤细胞的增殖，并能诱导胃癌细胞的凋亡，Western blot结果显示LY2606368降低Chk1的水平，并增加Chk1在Ser345位点的磷酸化，此外其能够上调DNA损伤标志物γ-H2AX及细胞凋亡标志蛋白cleaved-caspase3. 结论：Chk1敲低不仅能够显著抑制胃癌细胞的增殖，而且能够提高对电离辐射的敏感性。Chk1抑制剂LY2606368同样在胃癌细胞中显示出强力的抗肿瘤作用。 第二部分:Chk1抑制剂LY2606368能够显著提高胃癌细胞对PARP抑制剂BMN673的敏感性 目的：探寻潜在能够与Chk1抑制剂LY2606368联合用于胃癌治疗的药物 方法：首先用装有同源性重组修复报告质粒的U20S细胞检验了LY2606368对DNA损伤同源性重组修复的影响，为了减少LY260636对细胞周期的影响而造成的误差，用羟基脲同步各组细胞周期以准确检测LY2606368对同源性重组修复影响。MTS实验及平板克隆实验检测了LY2606368与BMN673胃癌中的协同抗肿瘤作用,Annexin V/PI双染法检验了LY2606368，BMN673和联合用药组在胃癌细胞AGS及MKN1中的促凋亡作用。Western blot检测了不同组中凋亡相关蛋白cleaved caspase3的表达，另外为了研究BMN673与LY2606368在胃癌中这种协同抗肿瘤作用的可能机制，PI染色法检测了LY2606368组，BMN673，联合用药组加药24小时后，AGS及MKN1细胞周期的变化，另外Western blot检测了各组中G2期标志物Cylcin B1及有丝分裂期标志物p-H3表达水平的变化。此外，成功建立了裸鼠人源性胃癌肿瘤模型，在体内实验水平，检验了LY2606368，BMN673，及两药联合的抗肿瘤效果。 结果：同源性重组修复报告实验结果表明，LY2606368对同源性重组修复有明显的影响，LY2606368处理24小时后，U20S细胞同源性重组修复能力明显降低,用羟基脲同步LY2606368加药组合对照组的细胞周期后，结果仍然显示，加药组中同源性重组修复较对照组也同样减低，MTS结果显示，较LY2606368单药组和BMN673单药组，联合用药组对胃癌细胞系AGS及MKN1中的细胞活力明显降低，平板克隆实验结果同样显示,AGS及MKN1细胞中，细胞克隆形成数显著降低，Annexin V/PI染色显示在AGS及MKN1细胞系，LY2606368和BMN673联合用药组中的凋亡率比单药组高，Western blot的结果显示联合用药组有更高的凋亡相关蛋白Cleaved-caspase3的表达。细胞周期分析结果显示LY2606368能够损害G2M期周期检查点，减少BMN673诱导的G2M周期阻滞，Western blot结果显示联合用药组中G2期标志物Cyclin B1的表达明显降低，而有丝分裂期标志物p-H3的水平明显上升。最后，在裸鼠人源性胃癌模型中，LY2606368联合BMN673治疗组中的肿瘤体积及肿瘤重量较对照组及LY2606368组和BMN673组单药组明显降低，显示了良好的抗肿瘤效果。 结论：LY2606368能够抑制细胞DNA同源性重组修复的水平，LY2606368联合PARP抑制剂BMN673在胃癌细胞中显出出强力的协同抗肿瘤作用。
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