摘要
磷酸三（2-丁氧基）乙酯(Tris(2-butoxyethyl) phosphate，TBOEP)是一种能够对水生生物及其相关生态系统带来严重风险的环境污染物。近年来，有报道研究了TBOEP暴露对生物体造成生殖、发育等方面的毒性。然而，很少有报道评估其对斑马鱼幼鱼神经毒性作用。在本研究中，受试动物斑马鱼胚胎在受精后(post-fertilization，hpf)2 h内分别暴露在0，50，500，1500和2500μg/L的TBOEP中144hpf。行为测试结果表明，TBOEP暴露降低了胚胎自主运动以及幼鱼在黑暗刺激反应中的平均游泳速度。根据这些运动效应，TBOEP暴露可降低转基因斑马鱼Tg(HuC-GFP)体内特异性神经元表达，抑制次级运动神经元轴突的生长，降低与中枢神经系统发育有关的标记基因的表达水平。此外，检测到TBOEP暴露组中幼鱼活性氧(Reactive oxygen species，ROS)水平下降、丙二醛(Malondialdehyde，MDA)含量增加以及超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)活性降低。结果表明，运动神经元和氧化应激的改变能够引起TBOEP诱导运动行为改变。本实验结果如下所示: 1.结果显示，经TBOEP处理96 hpf的幼鱼孵化率和144hpf的存活率仅在最高处理组中出现显著降低。同时，暴露于500，1500和2500μg/L的TBOEP中的幼鱼心率在96 hpf显著下降。此外，144hpf时，500，1500和2500μg/L TBOEP处理组中的幼鱼体长与对照组幼鱼体长相比明显降低。然而，与对照样品比较，TBOEP的暴露并未显著影响畸形率。 2.在对照组中，胚胎于20hpf时开始左右交替收缩，并且在22 hpf时逐渐达到16 bends/min的峰值，然后在28 hpf时缓慢下降到9 bends/min;暴露于500，1500和2500μg/L TBOEP中的胚胎自发运动的发作时间(～20 hpf)没有发生变化，但在22 hpf时弯曲频率显著降低;2500μg/L TBOEP处理组中的幼鱼在20-28hpf时自发运动显著降低。 在光暗交替周期刺激下进一步评估144hpf幼鱼的运动活性。当幼鱼从黑暗到光照时，游泳速度通常迅速下降，反之亦然。在5分钟的黑暗期间，1500和2500μg/L TBOEP处理组中幼鱼的平均游泳速度与对照组相比显著下降。 3.形态学分析显示，暴露于1500和2500μg/L TBOEP中幼鱼次级运动神经元背部和腹部轴突的长度显著减少。我们通过qRT-PCR进一步评估了与轴突发育相关基因的表达。同对照组相比，α1-tublin的表达仅在2500μg/L TBOEP处理组中明显下降;暴露于500，1500和2500μg/L TBOEP中的幼鱼，shha和syn2a的转录水平在144 hpf显著下调;经不同浓度TBOEP处理的幼鱼，gap43的转录水平显著下调。 4.同对照组相比，转基因斑马鱼Tg(HuC-GFP)暴露于1500和2500μg/L的TBOEP中144 hpf,幼鱼脑和脊髓中特异性神经元表达明显下降;然而，较低浓度TBOEP暴露组(50和500μg/L)中幼鱼脑和脊髓中特异性神经元表达与对照组相比没有明显差异。 5.同对照组相比，50，500，1500和2500μg/L TBOEP暴露组中幼鱼mbp和gfap的表达显著下调;同时，暴露于500，1500和2500μg/L TBOEP处理组中，elavl3和nkx2.2a的转录水平显著下调;暴露于2500μg/L TBOEP后，nestin和nr4a2b的表达显著降低;此外，neurogenin和ache的表达没有发生明显变化。 6.同对照组相比，500，1500和2500μg/L TBOEP处理组中幼鱼ROS活性明显升高;同时，仅在2500μg/L TBOEP暴露组中观察到MDA含量明显增加;暴露于1500和2500μg/L TBOEP中幼鱼SOD活性降低。 总之，这些结果表明，TBOEP暴露对斑马鱼幼鱼的神经行为产生了一定的改变，同时也影响了与斑马鱼幼鱼运动行为相关的次级运动神经元轴突的形成与生长。因此，我们不应该忽视水生环境中TBOEP的毒性影响，需要对其致毒机制做进一步的研究。
NETL