摘要
目的：克山病(KD)是一种以心肌损伤为主要病理改变的地方性疾病，主要病因假说包括低硒和真菌毒素感染等。黄绿青霉素(CIT)是病区中的主要真菌毒素，广泛存在于发霉谷物中，具有心脏、肝脏毒性等多种毒性作用，可以诱导细胞发生凋亡。有研究表明心源性脚气病也与CIT有关。硒(Se)是人体必需的微量元素，具有抗氧化、抗炎等多种生物功能，实践表明合理补硒可以有效降低KD的发病率并改善预后，但具体机制不明。维生素B1(VBl)也称硫胺素，是人体必需的一种水溶性维生素，当发生硫胺素缺乏(TD)时可引发心源性脚气病，临床实践表明补充VB1可以有效缓解心肌损伤症状，但其机制尚不明确。自噬对维持细胞内环境稳态具有重要作用，但过度自噬会造成多种损伤，目前自噬在Se和VB1心肌保护中的作用尚不明确。本研究拟探讨Se和VB1对CIT所致心肌损伤的干预机制。 方法：体内试验中，以5周龄ICR雄性小鼠为实验对象，腹腔注射含0mg/kgbw、0.1mg/kg bw、0.3mg/kg bw CIT的生理盐水（含0.2％DMSO）20ml/kg bw/day，Se和VB1干预组各提供含Se(9mg/L)和VBl(20g/L)的饮水，同时腹腔注射含O mg/kg bw、0.3mg/kg bw CIT的生理盐水(含0.2％DMSO)20ml/kg bw/day，共6周。用电子显微镜观察小鼠心肌细胞中的自噬小体;用免疫蛋白印迹法(Western blot)检测小鼠心肌中自噬生物标记物微管相关蛋白1轻链3(LC3)-Ⅱ蛋白、Sequestosome1(P62)蛋白，组织蛋白酶B(Cathepsin B)蛋白，线粒体外膜通透性改变生物标记物细胞色素c(Cyt c)蛋白及线粒体凋亡生物标记物B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)蛋白及Bcl-2相关X蛋白(Bax)蛋白的表达情况;用苏木素-伊红(HE)染色观察小鼠心肌病理改变情况;用酶联免疫法(ELISA)检测小鼠血清中心肌损伤标记物肌酸激酶MB同工酶(CK-MB)、心肌肌钙蛋白(cTnT)含量。 体外实验中，以大鼠心肌细胞H9c2为研究对象，8μM CIT作用于H9c2细胞12h、24h和36h。用电子显微镜观察细胞中的自噬小体;用荧光显微镜观察经吖啶橙(AO)染色的细胞溶酶体膜通透性改变情况;用荧光显微镜观察经JC-1染色的细胞线粒体膜电位(△Ψm)改变情况;用Western blot检测细胞中LC3-Ⅱ蛋白、P62蛋白，Bcl-2蛋白及Bax蛋白的表达情况;分光光度法检测细胞中含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(Caspase-3)活性;用TUNEL染色检测细胞凋亡情况;用ELISA检测培基中CK-MB、cTnY心肌酶水平。预先用自噬抑制剂3-MA及Se和VB1处理后，再以上述同样的方式用CIT处理细胞，分别检测上述各种方法中测得的实验指标的变化情况。 结果：在体内实验中，电子显微镜下可见暴露于不同浓度CIT(0.1mg/kg bw、0.3mg/kg bw)后，小鼠心肌细胞中自噬小体数量增多，Se和VB1保护组未见明显自噬小体聚集;染毒后小鼠心肌中LC3-Ⅱ蛋白表达升高，P62蛋白的变化趋势与之相反，Se和VB1保护组LC3-Ⅱ蛋白表达较0.3mg/kg bw CIT处理组降低，P62蛋白升高;染毒后小鼠心脏组织中Cathepsm B蛋白水平升高，Se和VB1保护组Cathepsin B蛋白水平较0.3mg/kg bw CIT处理组降低;染毒后小鼠心肌中Cyt c蛋白水平升高，Se和VB1保护组Cyt c蛋白水平较0.3mg/kg bw CIT处理组降低;染毒后小鼠心肌中Bax蛋白表达升高，Bcl-2蛋白的变化趋势与之相反，Se和VB1保护组Bax蛋白表达较0.3mg/kg bw CIT处理组降低，Bcl-2蛋白升高;染毒后小鼠血清中CK-MB、cTnT心肌酶水平升高，Se和VB1保护组CK-MB、cTnT心肌酶水平较0.3mg/kg bw CIT处理组降低;染毒后小鼠心肌HE染色可见明显病理改变，Se和VB1保护组病理改变不明显。 体外实验中，电子显微镜下可见暴露于8μM CIT后，H9c2细胞中自噬小体增加，Se和VB1保护组自噬小体数量与之相比明显减少;8μM CIT处理12h，细胞中LC3-Ⅱ蛋白表达升高，P62蛋白的变化趋势与之相反，经Se和VB1预处理后LC3-Ⅱ蛋白表达较8μM CIT处理组降低，P62蛋白升高;荧光显微镜下观察到8μM CIT处理细胞24h后，溶酶体膜稳定性下降，通透性增加，而经3-MA、Se和VB1预处理后溶酶体膜通透性增加情况与8μM CIT处理组相比有明显缓解;荧光显微镜下观察到8μM CIT处理细胞24h后，线粒体膜电位下降，而经3-MA、Se和VB1预处理后线粒体膜电位下降程度较8μMCIT处理组有明显缓解;8μM CIT处理细胞24h后，细胞中Bax蛋白表达升高，Bcl-2蛋白的变化趋势与之相反，经3-MA、Se和VB1预处理后Bax蛋白表达较8μM CIT处理组降低，Bcl-2蛋白升高;分光光度法检测Caspase-3活性发现8μM CIT处理细胞36h后细胞中Caspase-3活性增加，经3-MA、Se和VB1预处理后Caspase-3活性与8μM CIT处理组相比明显降低;TUNEL染色检测发现细胞在8μM CIT处理36h后发生凋亡，用3-MA、Se和VB1预处理后，细胞凋亡较8μM CIT处理组明显缓解;8μM CIT处理36h，细胞培养液中CK-MB、cTnT心肌酶水平升高，经Se和VB1预处理后CK-MB、cTnT心肌酶水平较8μM CIT处理组明显降低。 结论：CIT可以引起过度自噬，同时通过溶酶体-线粒体轴诱发凋亡;Se和VB1均可通过抑制自噬来缓解CIT暴露所致的自噬依赖性凋亡，从而发挥保护心肌的作用。
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