摘要
由指状青霉引起的绿霉病是柑橘采后最严重的真菌性病害之一。目前柑橘防治还是以化学防治为主，然而化学药剂的环境污染、农药残毒量及抗药病原菌的出现都迫使人们去寻找更安全的防治方法。因此研究柑橘指状青霉的致病机理，对其更好防控具有重要的理论和应用价值。实验通过根癌农杆菌介导指状青霉转化体系，建立扩大转化子突变体库。对筛选出的不致病突变株P44-14-44，从生理水平分析其与野生菌株的表型差异，在分子水平上确定导致表型变化的突变基因，针对突变基因进行定点敲除，分析基因功能。主要研究结果如下: 1、突变体库的扩建。通过农杆菌介导指状青霉转化已获得1000多个转化子，能在潮霉素上稳定生长，经过随机PCR验证均能扩增出潮霉素磷酸转移酶基因。 2、比较突变株与野生株的生理水平差异。(1)对突变株与野生株分别进行扫描和透射电镜观察。扫描电镜下，观察到野生株明显的帚状结构，突变株只有菌丝体，没有帚状结构。透射电镜下，野生株分生孢子细胞结构完整，细胞壁、隔膜、细胞膜及内部的细胞器明显，突变株细胞壁外围明显加黑加粗;(2)测量了接种突变株与野生株柑橘表面的pH。将无菌水、野生菌和突变菌孢子悬浮液分别接种到温州蜜柑和纽荷尔脐橙，用平面pH计测量伤口表面pH，接种野生菌温州蜜柑伤口处第三天pH从5.5下降到3.9，纽荷尔脐橙伤口pH从5.3下降到3.3，但是接种突变菌的和接种无菌水的结果保持一致，都没有明显的变化;(3)分析野生菌与突变菌的生长速率与孢子产量，培养第8d时，野生菌菌苔的生长直径是突变菌的5倍，第13d时野生菌菌苔直径是突变菌的近4倍，野生菌的孢子数量是突变菌的近7倍，发现突变菌的生长速率和孢子产量都明显低于野生菌。 3、突变株分子水平解析。(1)通过重测序技术确定了突变菌的T-DNA拷贝数与插入位点，测序结果与之前的Southern blot和Tail-PCR结果保持一致。突变菌有3个T-DNA拷贝插入，有2个T-DNA插入导致两个基因发生突变，分别命名为269、275基因，还有一个T-DNA插入位点位于两个基因间隔区;(2)针对两个突变基因269、275，通过基因敲除的方法研究突变基因与指状青霉致病性之间的关系。
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