摘要
茶树作为一种多年生叶用经济作物，充足的氮营养对其生长发育、生理生化代谢过程以及茶叶品质的形成起着至关重要的作用。然而，茶树对氮素的吸收利用能力有限，而且茶树偏爱铵态氮(NH4+-N)，对不同氮源的利用效率存在差异，因此一般的茶园管理中，为保证经济效益，氮肥过量施用的情况较为普遍，但这必然会造成资源浪费和环境污染。谷氨酰胺合成酶(Glutamine synthetase，GS;EC6.31.2)是高等植物氮素同化过程中最为关键的催化酶之一，与植物氮素吸收、同化和利用效率(Nitrogen use efficiency，NUE)紧密相关，更重要的是，不同GS酶的基因成员在植物氮素吸收同化中功能不同。 本研究以茶树栽培种龙井43为研究对象，克隆了参与氮同化的获得3个CsGS1基因的cDNA全长，对GS1s的表达产物的亚细胞定位和蛋白酶活性进行了研究，并研究了3个CsGS1基因在不同氮源中的表达模式和它们的组织特异性，以揭示其在茶树氮代谢中的具体功能作用。主要研究结果如下: 1.克隆了3个茶树胞质型谷氨酰胺合成酶基因CsGS1.1、CsGS1.2和CsGS1.3，生物信息学分析CsGS1s编码的蛋白均具有GS家族的保守结构域—Gln-synt C，为亲水性的位于细胞质中的非分泌型蛋白质，没有信号肽。通过Blast分析及进化树构建可知，茶树CsGS1.1与葡萄GS1.1的亲缘关系最近，茶树CsGS1.2、CsGS1.3与毛白杨GS1的亲缘关系最近;CsGS1.1s与拟南芥AtGln1;5、油菜BnGln1;5、大麦HvGS1;3、水稻OsGS1;3以及玉米ZmGS1;3表现出较近的亲缘关系。 2.将克隆的3个CsGS1s基因各自的编码区分别与定位报告基因—绿色荧光蛋白GFP基因融合，对CsGS1s的表达产物进行精准的亚细胞定位。结果表明，CsGS1.1定位于细胞膜、质和核中，CsGS1.2定位于细胞膜、质中，CsGS1.3定位于细胞膜、质中。 3.分别对3个CsGS1s编码区进行原核表达，纯化得到各对应的重组蛋白质。SDS-PAGE电泳结果蛋白CsGS1s分别约为42、42和58kD。分析各重组蛋白质的谷氨酰胺合成酶催化特性显示，3个重组CsGS1s蛋白均能催化谷氨酸和氨反应，生成谷氨酰胺。 4.茶树CsGS1s基因的表达存在时空特异性，即CsGS1.1/CsGS1.3基因在根部的相对表达量最高，CsGS1.2则主要在成熟叶中表达，但总体来看CsGS1.2在根茎叶中的相对表达丰度明显低于CsGS1.1/CsGS1.3。分别对NH4+-N、NO3--N两种培养条件下的3个CsGS1s的表达情况进行分析。在叶中，CsGS1.1的表达量在NO3-处理后期显著提高，而CsGS1.2/CsGS1.3主要对NH4+处理有响应;在茶树根中，CsGS1s的表达水平受NH4+-N的诱导显著高于NO3--N，尤其是CsGS1.1/CsGS1.2。
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