摘要
采用耐盐砧木嫁接能显著提高植物耐盐性，课题组前期研究已经从盐害离子转运、抗氧化系统、光合作用等方面阐述了嫁接提高黄瓜耐盐性的机制。近年来，活性氧(ROS)作为一种重要信号物质被广泛关注。大量研究已经证明其参与响应多种生物及非生物胁迫的过程，其中关于H2O2信号介导提高植物耐盐性的机制已在不同物种中被报道，但嫁接复合体中H2O2信号与耐盐性的关系还有待研究。本课题通过构建耐盐性不同的两种嫁接复合体，研究了H2O2信号在嫁接提高黄瓜耐盐性中的作用，所取得主要结果如下。 1.75mM NaCl处理未造成根系质膜损伤但可作为研究嫁接黄瓜H2O2信号的适宜盐胁迫浓度。通过比较不同NaCl浓度处理后南瓜嫁接苗(C/P)和黄瓜自嫁苗(C/C)总干重、叶面积、叶片数、Fv/Fm、H2O2积累和相对电导率(REC)等方面的差异，发现75mM NaCl处理对嫁接组合总干重、叶面积、叶片数和叶绿素荧光均存在显著差异，而根系电解质渗透率(REC)与H2O2含量相比不加NaCl处理无显著升高，表明75mM NaCl处理未对嫁接苗根系产生质膜损伤，而不同嫁接组合耐盐性在此浓度下存在显著差异，可作为研究H2O2信号的盐处理浓度。 2.南瓜嫁接苗根源H2O2信号在盐胁迫早期形成并快速向地上部传递。研究了不同嫁接组合根源H2O2信号在地上部、地下部的形成规律，测定75mM NaCl浓度下南瓜嫁接苗(C/P)和黄瓜自嫁苗(C/C)在不同处理时间(1h、3h、12h、24h、48h及120h)下Na+、K+和H2O2在叶片和根部的积累情况，叶片Fv/Fm及Na+转运系统中两个关键基因PMA和SOS1的表达情况。结果表明不同嫁接组合H2O2和Na+积累模式存在显著差异，虽然南瓜嫁接苗和黄瓜自嫁苗根系H2O2均在NaCl处理3h后达到峰值，但南瓜嫁接苗叶片中H2O2随根部H2O2升高而迅速增加，而黄瓜自嫁苗叶片H2O2的形成则相对滞后。对叶片Na+和H2O2积累过程的研究发现，H2O2在南瓜嫁接苗叶片中形成早于Na+积累，表明该H2O2信号并非由叶片Na+积累而产生。结合75mM NaCl处理下两个嫁接组合根系SOS1和PMA表达情况分析，表明两个嫁接组合SOS1均受NaCl诱导而表达上调，而PMA仅在南瓜嫁接苗中上调表达，南瓜嫁接苗根源H2O2信号所介导的Na+外排更多依赖于PMA。利用体外瞬间滴加NaCl观测H2O2在南瓜根尖形成过程，发现南瓜根系H2O2荧光在盐处理2min后即可快速形成，并可快速向地上部转移。 3.根源H2O2信号介导了根系Na+/H+反转运系统参与的Na+外排过程，该信号由根系质膜NADPH氧化酶产生。利用NADPH氧化酶专一抑制剂二苯基氯化碘盐(DPI)预处理根系，研究了根源H2O2信号在调控Na+向地上部转运过程中的作用，结果表明DPI预处理能显著增加南瓜嫁接苗叶片中Na+含量。进一步通过非损伤微测技术(NMT)对南瓜嫁接苗和黄瓜自嫁苗根中Na+、K+和H+，茎中Na+、K+离子流速情况进行监测，证明南瓜嫁接苗DPI预处理后叶片Na+积累的增加源于根系Na+外排作用的降低。对质膜H+-ATPase活性的测定结果表明DPI预处理对其有显著抑制作用，同时编码H+-ATPase的基因PMA受DPI预处理显著下调，表明根源NADPH氧化酶所产生的H2O2信号通过维持H+-ATPase活性介导盐胁迫下Na+外排。 4.根源H2O2信号参与盐胁迫下南瓜嫁接苗调控地上部抗氧化系统的激活过程。通过测定75mM NaCl处理下两个嫁接组合叶片和根系APX、CAT、POD和SOD活性随时间变化情况，发现南瓜嫁接苗早期叶片抗氧化酶活性升高早于黄瓜自嫁苗，而DPI预处理显著影响了上述4种酶的活性，证明根源H2O2信号对南瓜嫁接苗叶片中4种抗氧化酶活激活具有重要意义，表明南瓜嫁接苗根源H2O2信号具有更强的调控地上部抗氧化系统的能力。利用ABA合成抑制剂氟啶酮(Fluridone)和NADPH氧化酶抑制剂DPI实验研究了两个嫁接组合木质部汁液中ABA含量，发现Fluridone和DPI均能降低ABA在木质部中的含量。表明木质部中升高的ABA可能是南瓜嫁接苗早期诱导地上部抗氧化酶基因表达、调控气孔快速关闭的原因，且根源NADPH氧化酶所产生的H2O2介导了这一过程。 5.南瓜Rboh家族基因成员数量大于黄瓜且各成员在不同胁迫环境下表达情况存在差异。通过构建拟南芥(Arabidopsis thaliana)、中国南瓜(Cucurbita moschata)、印度南瓜(Cucurbita maxima)和黄瓜(Cucumis sativus)Rboh家族成员的系统发生树，发现中国南瓜和印度南瓜相比黄瓜具有更多的Rboh家族成员，其中中国南瓜共有10个Rboh成员，而黄瓜只有7个。对中国南瓜Rboh家族基因在NaCl、ABA、山梨醇和H2O2处理后1h、3h和24h下基因表达进行定量分析，发现山梨醇等渗处理并不能产生与NaCl处理相同的效果，这表明南瓜根系Rboh虽然受ABA信号直接调控，但南瓜根系感知NaCl胁迫和渗透胁迫可能是两个相互独立的途径。为了更好地适应渗透胁迫（如干旱环境），南瓜可能进化成类似CmoCh10G011970类型的成员，通过与其他成员进行功能互补，提高南瓜在不同逆境中的抗性。此外，对南瓜和黄瓜Rboh家族的3个成员在烟草表皮细胞中的亚细胞定位证明这些基因均位于细胞质膜上。 综上所述，本研究首次揭示了嫁接提高作物耐盐性依赖于根源H2O2信号调控的Na+外排途径。根源H2O2信号通过介导根系Na+/H+反转运系统维持Na+外排，诱导早期气孔关闭，激活地上部抗氧化酶活性，提高了嫁接黄瓜耐盐力。
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