摘要
背景： 长链非编码RNA(long non-coding RNA, lncRNA)是一类长度超过200nt的RNA，它们本身并不编码蛋白，而是以 RNA的形式在多层面上（表观遗传调控，转录调控以及转录后调控等）调节基因的表达【1】。近年来的研究表明， LncRNA广泛参与各种生物学的过程，LncRNA的异常表达与包括肿瘤在内的多种疾病密切相关。已有证据证明lncRNA参与肝癌、胰腺癌、胶质瘤等多种恶性肿瘤的发生发展【2-5】，但lncRNA在鼻咽癌中的功能机制研究鲜有报道。 鼻咽癌的发病率有明显的地域差异性，在我国南方、北非及部分地中海地区是高发区域，特别在我国南方地区鼻咽癌明显高发。鼻咽癌预后与疾病分期密切相关，由于鼻咽肿瘤生长部位隐蔽，早期没有任何症状和体征，确诊时已有70％的患者是Ⅲ或ⅣA期的局部晚期鼻咽癌【6】。近年来，尽管鼻咽癌的诊治水平有了较大的提高，但其具体的发生机制仍不十分明确，临床治疗仍缺乏有效手段，5年生存率仅70%左右【7】，局部治疗失败和远处转是治疗失败的重要原因，因此，提高局部控制率和预防远处转移是局部晚期鼻咽癌患者治疗上面临的巨大挑战。近年来，lncRNA越来越多的成为人们研究的热点，但lncRNA与鼻咽癌的作用关系尚有待研究，尤其lncRNA与局部晚期鼻咽癌的关系更值得我们去探讨。 LncRNA基因芯片是目前广泛应用与研究1ncRNA表达谱的一种理想有效的方法。通过LncRNA基因芯片，能够快速高通量的获得与特定生物学过程或疾病相关的LncRNA的表达变化，从而为后续的LncRNA功能研究或生物标志物筛选提供极大便利。 目的： 本课题旨在研究与局部晚期鼻咽癌相关的lncRNA及其相关生物学功能，并初步探讨其发生机制，为后续鼻咽癌的研究提供理论和科学依据。 方法： 1、采用Human LncRNA Array V4.0检测局部晚期鼻咽癌组织及其对照的癌旁组织，得到两种组织之间 lncRNA和mRNA差异表达谱，综合NCBI Refseq, UCSC, RNAdb及LncRNAs等数据库资源，对芯片结果进行聚类分析、GO分析及Pathway分析等初步生物信息学分析。 2、体外培养鼻咽癌细胞CNE1和HONE1以及鼻咽正常上皮细胞NP69，运用Real-time PCR技术验证目标lncRNA在CNE1和HONE1与NP69的表达水平。 3、采用siRNA干扰技术干扰目标lncRNA表达后，运用Real-time PCR方法检测siRNA的转染效率，干扰目标lncRNA后检测目标lncRNA对鼻咽癌细胞生物学特性的影响。 4、应用CCK8法、Boyden侵袭实验、Transwell迁移实验和细胞划痕实验以及细胞凋亡实验，分别检测干扰目标lncRNA后，对鼻咽癌细胞株CNE1和HONE1增殖、侵袭、迁移以及凋亡能力的影响。 结果： 第一部分： 1、通过基因芯片技术成功筛选差异表达的lncRNA和mRNA，设定筛选标准：P值≤0.05， Foldchange≥1.5，筛选得到324个差异表达lncRNAs，上调226个，下调98个；同时有188个差异表达mRNAs，上调98个，下调90个。 2、Pathway结果显示：lncRNA潜在的靶基因mRNA可能参与的信号通路共有22条，其中表达上调的信号通路6条，下调的13条。GO分析表明,上调表达的mRNA生物过程、细胞组成、分子功能富集程度最高的条目分别是cell chemotaxis, collagen trimer和chemokine activity；下调表达的分别是protein localization to cytoskeleton，cell cortex和protein homodimerization activity。 第二部分： 1、实时荧光定量PCR实验结果显示， AW450413、ENST00000501541、ENST00000457325、uc003owl.1相对表达量增加， ENST00000448834、ENST00000554458、ENST00000433377相对表达量降低，与基因芯片结果一致。更重要的是，ENST00000501541在CNE1和HONE1上表达量明显高于NP69表达量，具有明显统计学差异（P＜0.05）。 2、CCK8增殖实验结果显示：与对照组(siRNA-NC)相比，实验组（siRNA-1）、实验组（siRNA-2）鼻咽癌细胞CNE1和HONE1增殖能力显著下降(P＜0.05)。 3、Transwell迁移实验显示:与对照组(siRNA-NC)相比，实验组（siRNA-1）每高倍镜下穿过的细胞数较对照组明显减少(P＜0.05)。 4、Boyden侵袭实验结果显示：与对照组(siRNA-NC)相比，实验组（siRNA-1）每高倍镜下穿过Matrigel膜的细胞数较对照组明显减少(P＜0.05)。 5、划痕实验结果显示：与空白组及阴性对照组相比，在48小时和72小时检测，实验组（siRNA-1）细胞划痕愈合能力较对照组显著下降(P＜0.05)。 6、凋亡实验结果显示：实验组（siRNA-1）相对于阴性对照组(shRNA-NC)，鼻咽癌细胞CNE1和HONE1凋亡细胞百分比显著增加(P＜0.05)。 结论： 1、我们利用lncRNA基因芯片研究发现了324个差异表达lncRNAs，并在鼻咽癌细胞株上验证了基因芯片结果的可靠性。 2、实验证明ENST00000501541在鼻咽癌组织及鼻咽癌细胞株中均上调表达，干扰细胞ENST00000501541表达水平能够抑制鼻咽癌细胞株增殖、迁移和侵袭能力以及促进细胞凋亡，结果提示ENST00000501541可能参与鼻咽癌的发生发展过程。 综上所述，我们的实验初步研究了ENST00000501541在体外对鼻咽癌细胞株的影响，为后续鼻咽癌的功能机制研究打下了基础，也为局部晚期鼻咽癌的研究提供了新的视角。
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