摘要
宫颈癌是女性常见肿瘤之一，在世界范围内发病率高居女性恶性肿瘤第二位。近20年来，我国宫颈癌的发病率和死亡率不断攀升，但是发病年龄却不断下降，宫颈癌已成为严重威胁女性身体健康的因素之一。根据已有文献报道，99.8%的宫颈癌患者均可检测到HPV感染，但是仅HPV感染并不足以引发宫颈癌，感染者自身基因发生相应的变化才会最终导致宫颈癌。目前宫颈癌的致病机理尚不明确，因此研究宫颈癌的致病机制对预防和治疗宫颈癌具有重大意义。 随着微阵列芯片和高通量测序技术的逐渐普及，目前已经发现仅有2%的转录本具有编码蛋白质的功能，而至少有75%的转录本是非编码RNA。在非编码RNA中，大部分转录本的长度超过200个核苷酸残基（nt），被称为长链非编码RNA。这些长链非编码RNA大多（并非全部）是由RNA聚合酶II转录，因此具有5′端帽子结构和3′端PolyA尾巴。近年来研究发现，LncRNA在基因表达过程中起到了重要的调控作用，参与了染色质修饰、X染色体沉默、基因组印记和转录激活、转录干扰等过程。已有研究证明其在肝癌、前列腺癌、乳腺癌、肺癌等癌症中存在特异性表达，与多种肿瘤的发生发展存在密切关系。目前已经发现多种与宫颈癌存在密切关系的LncRNA，包括MALAT1、H19、HOTAIR、MEG3、EBIC和ANRIL等，但是这也只是一小部分，还存在更多具有重要意义的LncRNA有待我们去发现。 为了筛选出宫颈癌相关LncRNAs并且研究其生物学功能，本实验室前期收集了25组未化疗宫颈癌病人的临床宫颈癌组织样本及对应的癌旁正常组织样本，从中随机选取5组样本组织，提取总RNA并纯化，用NanoDrop ND-2000和甲醛变性琼脂糖凝胶电泳进行质量检测，质检合格后采用 LncRNA芯片（型号Human LncRNA Microarray V3.0）进行杂交分析。以表达差异大于2倍，P＜0.05作为筛选标准，得到宫颈癌与癌旁组织差异表达的LncRNA共3378条，其中在癌组织中上调表达的有1192条，下调表达的有2186条。通过LncRNA数据库检索（包括UCSC、NCBI、RefSeq、Ensembl和 GENCODE等）和文献查阅，我们将目标锁定在可能影响宫颈癌生物学功能的Dleu2和 Loc728730两条LncRNA上。Dleu2位于13号染色体上，全长2768bp，在宫颈癌组织中较其对应癌旁组织表达水平平均降低2.16倍，它的删除是导致慢性淋巴细胞性白血病的重要原因。Loc728730位于2号染色体上，全长2517bp，在宫颈癌组织中较其对应的癌旁组织表达水平平均降低3.05倍，目前尚未有文献对其报道，是一个功能和机制完全未知的LncRNA。进一步利用q-PCR检测验证了LncRNA芯片筛选的结果，即相较于癌旁组织和正常宫颈上皮细胞系，LncRNA-Dleu2在宫颈癌组织和细胞中均低表达。 为了研究Dleu2的生物学功能，我们构建了pCDNA3.1(+)-Dleu2过表达载体。通过瞬时转染在细胞内过表达Dleu2，研究其对宫颈癌Hela和Caski细胞系增殖、迁移和侵袭的影响。CCK8细胞增殖实验结果显示，过表达Dleu272h后，Hela和Caski细胞增殖速度明显减慢，即增殖能力受到显著抑制（P＜0.01）；单克隆实验结果显示，过表达Dleu2后，Hela和Caski细胞形成单克隆的数量和大小都减少，即增殖能力受到明显抑制（P＜0.01）；细胞划痕实验结果显示，过表达Dleu248h后，划痕边缘细胞进入空白区域使“划痕”愈合速度减慢，表明Hela和Caski细胞增殖和迁移能力受到显著抑制；Transwell细胞侵袭实验结果显示，过表达Dleu248h后，Hela和Caski细胞在规定时间内穿过小室数量明显减少，即细胞的的侵袭能力明显减弱（P＜0.01）。总的来说，LncRNA-Dleu2在宫颈癌中相对低表达，提高Dleu2表达水平能够抑制宫颈癌细胞系Hela和Caski的增殖、迁移和侵袭能力。 同样，由于Loc728730是功能和机制完全未知的基因，为了研究其生物学功能，我们构建了pcDNA3.1(+)—Loc728730过表达载体。通过瞬时转染过表达载体，提高Hela和Caski细胞内Loc728739的表达水平，研究其对宫颈癌Hela和Caski细胞系增殖、迁移和侵袭能力的影响。结果显示：Loc728730能显著抑制Hela和 Caski细胞系的侵袭能力（P＜0.01），表明其是宫颈癌侵袭过程中重要的基因；同时Loc728730也能抑制Hela和Caski细胞系的增殖（P＜0.05）和迁移能力，但是效果远没有侵袭显著。为了探索Loc728730在侵袭过程中的作用机制，我们通过芯片结果分析猜测：Loc728730对其上游基因 MAP4K3蛋白激酶存在调控作用。为了验证猜测，在Hela和Caski细胞中过表达Loc728730后，利用qRT-PCR方法检测MAP4K3表达水平变化。结果发现过表达Loc728730之后， MAP4K3的mRNA表达水平在Hela细胞中增高，而在Caski细胞中降低，无法得出可靠结论，因此它们在转录水平上不存在抑制或者促进的关系。Loc728730是否可以通过其他途径调节 MAP4K3蛋白还有待验证，Loc728730在宫颈癌侵袭过程的作用机制也有待进一步探究。 综上所述，本研究通过基因芯片技术筛选出在宫颈癌组织中特异性表达的LncRNA：Dleu2和Loc728730。通过外源过表达的技术探讨了Dleu2和Loc728730对宫颈癌细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响。结果证明了 Dleu2和 Loc728730能够抑制宫颈癌细胞的增殖，并减弱其迁移和侵袭能力，这为宫颈癌的防治和筛查提供了新的思路，对于进一步揭示宫颈癌发生发展的病理机制具有重要意义。
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