摘要
实验目的： 炎症（inflammation）是具有血管系统的活体组织对损伤因子所发生的防御反应，炎症反应在很多疾病的病理过程中起着重要作用。动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)是危害人类健康的主要疾病之一，目前认为AS是具有慢性炎症反应特征的病理过程，其发展始终伴随炎症，慢性炎症介导其发生、发展的全过程。AS是多种心脑血管疾病的病理基础，加强对AS的病因、发病机制和防治的研究，对于延迟和逆转AS病变的进展，降低心脑血管疾病的发病率和病死率，具有很重要的意义。近年来，革兰阴性菌的细胞壁重要成分—脂多糖(lipopolysaccharides,LPS)与AS形成的关系成为研究的热点。多种炎性细胞和细胞因子参与了AS的进程，巨噬细胞作为AS斑块中的主要炎症细胞，可通过NF-κB途径产生多种炎症介质及炎症因子，促进AS斑块的形成和发展。本课题组在前期研究中证实了黄芩苷的抗AS效应，但对其作用机制并不完全清楚。本研究旨在探讨： （1）黄芩苷对NF-κB信号通路的调控作用； （2）黄芩苷对高脂血症小鼠血脂紊乱的干预作用。 实验方法： 本研究分为体内和体外实验两部分： 1.体内实验。C57BL/6小鼠高脂血症动物模型的建立及黄芩苷的干预作用 主要为以下实验： （1）C57BL/6小鼠用LPS腹腔注射联合高脂饮食建立高脂血症动物模型 用LPS腹腔注射联合高脂饮食建立小鼠高脂血症动物模型，具体方法如下：C57BL/6小鼠分笼适应性饲养3天后，随机分为5组，每组13只小鼠，分为五组：空白对照组、单纯高脂组、高脂+LPS组、黄芩苷高剂量组（高脂+LPS）、黄芩苷低剂量组（高脂+LPS）。空白对照组给予正常饮食喂养，其余各组均给予高脂饮食，正常饮水。3周后除空白组和单纯高脂组以外，其余腹腔注射LPS30μg/只，每周注射1次，共6次。LPS注射第3次后，高、低浓度黄芩苷治疗组开始每天给予黄芩苷腹腔注射，连续治疗7周。 （2）动物给予药物黄芩苷治疗7周后，禁食12小时，摘眼球取血，分离血清，采用酶法分析检测动物的血脂水平，包括总胆固醇（TC），甘油三酯（TG），高密度脂蛋白胆固醇（HDL），评价黄芩苷防治对血清中血脂含量的影响。 2.体外实验。探寻黄芩苷对NF-κB信号通路的调控作用，主要包括： （1）小鼠巨噬细胞(RAW264.7)的培养 将RAW264.7细胞在25c㎡的培养瓶内，用DMEM培养基（含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100μg/mL链霉素)5%CO2，37℃条件下培养，当长至80％融合时，用含胰蛋白酶-EDTA消化，传代。 （2）黄芩苷对RAW264.7肿瘤坏死因子-α和白细胞介素-6生成的影响 取生长状态良好的细胞用0.25%胰酶消化，台盼蓝染色鉴定细胞活率≥95%，用DMEM培养基调整细胞浓度为1×106/ml，每孔1ml接种到24孔培养板内，待细胞生长至80%融合后，加入不同浓度的黄芩苷（终浓度分别为10,50,100μmol/L）孵育1h，然后加入LPS（终浓度1μg/mL）进行刺激。实验分组如下：正常对照组、黄芩苷组、LPS组和黄芩苷加LPS组。RAW264.7细胞加入黄芩苷和LPS后继续培养18h，收集各处理组细胞培养上清液，采用酶联免疫吸附法，用TNF-α和IL-6Elisa试剂盒检测上清液中细胞因子的含量。酶标仪在波长570nm处测OD值。 （3）黄芩苷对TNF-α、IL-6 mRNA表达的影响 ①取对数生长期的细胞以1×106/m的浓度接种于24孔培养板内，待细胞生长至80%融合后，加入不同浓度的黄芩苷（终浓度分别为10,50,100μmol/L）孵育1h，然后加入LPS（终浓度1μg/mL）进行刺激。实验分组如下：正常对照组、黄芩苷组、LPS组和黄芩苷加LPS组；培养6h后，用Trizol法提取细胞总RNA。 ②逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测TNF-α、IL-6 mRNA的表达 以总RNA为模板，以Oligo-d（T）18为引物逆转录合成第一链cDNA，用特异性引物分别扩增TNF-α、IL-6和β-Actin。 TNF-α引物序列如下，Sense：5’-ATG AGC ACA GAA AGC ATG ATC-3’，Antisense：5’-TAC AGG CTT GTC ACT CGA ATT-3’； IL-6引物序列如下，Sense：5’-TTC CCT ACT TCA CAA GTC-3’，Antisense：5’-ACT AGG TTT GCC GAG TAG-3’； β-Actin引物序列如下，Sense：5’-TGA ACC CTA AGG CCA ACC-3’，Antisense：5’-CCA CAG GAT TCC ATA CCC-3’。 PCR程序进行反应：首先94℃预变性4min，然后94℃变性45s，55℃复性30s，72℃延伸30s，共循环30次，最后72℃延伸5min，4℃停止。 内参基因采用β肌动蛋白（β-actin）。 用Qautity One软件分析目的基因与内参β-Actin基因的PCR产物灰度值，以目标基因与内参基因灰度比值来表示目的基因mRNA的相对表达量。 （4）黄芩苷对核NF-κB p65蛋白表达的影响 取对数生长期的细胞以1×106/m的浓度接种于24孔培养板内，待细胞生长至80%融合后，加入不同浓度的黄芩苷（终浓度分别为10,50,100μmol/L）孵育1h，然后加入LPS（终浓度1μg/mL）进行刺激。实验分组如下：正常对照组、黄芩苷组、LPS组和黄芩苷加LPS组；RAW264.7细胞加入刺激物后继续培养30min，以冰冷的PBS终止刺激，用细胞刮子将细胞刮下，5000rpm离心洗涤细胞2次，提取细胞核蛋白，按试剂盒说明书操作。BCA蛋白定量试剂盒测定核蛋白浓度，分装，-80℃贮存备用。 核NF-κB p65蛋白的免疫印迹检测，用β-actin单抗做内参。用图象分析系统分析目标带灰度值，以目的蛋白与内参β-Actin蛋白的灰度比值来表示目的蛋白的相对表达量。 实验结果： 1.各组实验小鼠血脂水平 （1）高脂血症小鼠模型的建立 C57BL/6小鼠用LPS腹腔注射联合高脂饮食，成功建造高脂血症小鼠动物模型。模型建造成功后，单纯高脂模型组比空白对照组血清中TC、TG含量升高（P<0.001， P<0.01），有统计学意义。高脂+LPS模型组血清中TC、TG含量明显升高，与空白对照组比较差异显著（P<0.001）。与空白组相比较，高脂+LPS模型组HDL-C含量降低明显（P<0.05），有统计学意义。提示高脂血症小鼠模型的建立成功。 （2）黄芩苷对高脂+LPS模型组实验小鼠血清血脂的影响 与高脂+LPS模型组比较，黄芩苷组高剂量和低剂量组的HDL-C含量比模型组均有所升高，其中低剂量黄芩苷组升高尤其明显（P<0.001），而高剂量黄芩苷组（P<0.01），两者均有统计学意义。 黄芩苷组高剂量和低剂量组的TC、TG含量均有下降的趋势，但是没有统计学意义。 2.小鼠巨噬细胞(RAW264.7)的培养 在倒置显微镜下观察到RAW264.7为贴壁细胞，形状呈圆形或不规则形，呈“铺路石”样紧密镶嵌排列。 3.黄芩苷对RAW264.7细胞因子TNF-α、IL-6生成的影响 在正常情况下，巨噬细胞RAW264.7培养上清中TNF-α、IL-6含量极低，100μmol/L浓度的黄芩苷单独作用无明显影响，与正常对照组比较，无统计学意义。1μg/mL LPS刺激可以显著促进RAW264.7细胞TNF-α和IL-6合成，与正常对照组比较P<0.01。在10-100μmol/L浓度范围内，黄芩苷预处理均能有效抑制LPS诱导的TNF-α、IL-6表达，并且存在药物浓度依赖性，与LPS组比较有显著性差异（P<0.01）。 4．黄芩苷对TNF-α、IL-6 mRNA表达的影响 巨噬细胞TNF-α、IL-6基因在正常情况下表达极低，单独加入黄芩苷对其表达也没有影响。LPS刺激后，巨噬细胞TNF-α、IL-6基因表达上调，而在LPS刺激前加入黄芩苷预处理，可以显著降低TNF-α、IL-6 mRNA表达水平。10μmol/L黄芩苷作用组与LPS组比较P<0.05，50μmol/L和100μmol/L黄芩苷作用组与LPS组比较P<0.01，表明黄芩苷可以有效抑制LPS引起的TNF-α、IL-6基因表达。 5.黄芩苷对核NF-κB p65蛋白表达的影响 NF-κB在正常情况下以无活性的三聚体形式存在于胞浆中，受胞外刺激活化进入细胞核引起下游多种基因表达，NF-κB通路是LPS诱导炎症因子表达的关键信号通路。Western Blot结果显示，在正常情况下巨噬细胞胞核内仅有少量的NF-κB p65，在LPS诱导下巨噬细胞NF-κB活化，核内NF-κB p65含量显著增加。LPS刺激前用黄芩苷预处理，可下调胞核内NF-κB p65水平，说明黄芩苷可以抑制LPS引起的巨噬细胞NF-κB信号途径活化。 实验结论： 黄芩苷的干预使高脂血症小鼠血清HDL-C水平升高，高密度脂蛋白具有抗AS的作用，证实黄芩苷能通过调节血脂的作用而减少动脉粥样硬化的危险因素。这在一定程度上抑制了AS的发生。 LPS可以激活巨噬细胞的NF-κB信号分子，细胞核内NF-κBp65蛋白增多，诱导巨噬细胞大量表达炎症因子TNF-α和IL-6。而黄芩苷预处理则可以减轻LPS引起的炎症反应，减少巨噬细胞NF-κB p65入核，降低了NF-κB的活性，从而抑制炎症因子TNF-α、IL-6的表达。实验结果表明黄芩苷能通过抑制NF-κB信号分子活化和炎症因子TNF-α、IL-6的过度表达，抑制炎症反应，从抗炎角度初步明确了黄芩苷抗AS的作用机制。 本研究分别采用了体内和体外实验的方法，探讨了黄芩苷在调脂、信号通路的活化以及炎症因子几个方面抑制AS的作用与机制。
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