摘要
食品的生物性污染所造成的食源性疾病已成为影响食品安全的突出问题，日益受到全球各国的关注。诺如病毒（Noroviruses，NoVs）是一种引发人类非细菌性急性胃肠炎的主要病原体，近年来在全球范围内呈现流行趋势，严重时可导致患者死亡，给消费者健康造成了巨大威胁。牡蛎肉质鲜美，营养丰富，产量巨大，2015年我国牡蛎养殖面积已达14万公顷，比2014年增长6.1%，牡蛎养殖总产量超过457万吨，占我国贝类养殖总产量的33.03%。然而，牡蛎作为NoVs的重要传播媒介，是公认的引起病毒性急性胃肠炎疫情暴发的高风险食品，大量的调查研究结果显示，大多数贝类引发的NoVs疫情与食用牡蛎相关，且常规的贝类净化加工方法难以有效地将NoVs从牡蛎体内除去。人体组织血型抗原（Histo-Blood Group Antigens，HBGAs）是人类结合NoVs的受体，在不同人体对NoVs易感性的差异中起着重要作用。Tian等研究发现，牡蛎中也存在人 HBGAs类似物特异性结合NoVs，这可能是牡蛎体内富集NoVs的原因。 本研究从NoVs在长牡蛎(Crassostrea gigas)中的结合受体角度出发，通过比较5种常用糖蛋白的浸提方法，分别建立了长牡蛎内脏和鳃中类HBGAs的提取方法；运用建立的提取方法结合ELISA检测方法，对长牡蛎类HBGAs进行了组织分布与分型检测；通过改变温度和盐度的牡蛎养殖条件，分析了长牡蛎内脏和鳃中主要型别类HBGAs及类FUT2基因的表达变化；通过DEAE Sepharose FF阴离子交换层析色谱和SepharcrylTM S-300凝胶色谱对长牡蛎类A型HBGA进行了初步分离纯化，并运用MALDI-TOF-TOF-MS、红外光谱、GC/MS及单糖组成分析等分析方法对长牡蛎类A型HBGA的结构进行了初步探索，为进一步研究长牡蛎富集NoVs的机制提供了理论研究基础。本研究的主要结论如下： 1.优化了长牡蛎类HBGAs的提取方法，对其内脏和鳃中的类HBGAs进行了分型。在长牡蛎类 HBGAs提取的方法优化中以水作为浸提液提取牡蛎类HBGA的方法优于以PBS为浸提液的提取方法，且不同组织中类HBGAs的提取方法不同；运用建立的方法对24份（240只）长牡蛎进行检测分型，发现长牡蛎内脏和鳃中的类 HBGAs存在多态性的特点，并首次发现了类 Leb型HBGA在长牡蛎鳃中稳定表达（检出率为91.7%），类A型HBGA在长牡蛎内脏和鳃中稳定表达（检出率分别为100%和83.3%）； 2.研究了温度盐度对牡蛎类HBGAs及其合成关键基因表达的影响。在对长牡蛎内脏和鳃中主要型别类HBGAs及类FUT2基因的表达受温度盐度影响的分析中，发现长牡蛎内脏中类A型HBGA及类FUT2基因的表达量在低温和高盐的条件下显著增加，这与诺如病毒疫情暴发的季节相吻合，间接表明了诺如病毒疫情暴发的季节性与长牡蛎类 FUT2基因的表达量及类 HBGAs的表达量均存在一定的相关性。 3.牡蛎内脏中类A型HBGA的分离纯化。运用DEAE-sepharose fast flow阴离子交换层析色谱法对长牡蛎内脏类HBGAs粗提取液进行分离纯化，获得F1和F2两部分纯化组分，将F2样品利用Sepharcryl S-300凝胶色谱进一步分离纯化，获得纯化组分 YY1用于单糖组成分析、气质联用、红外光谱等实验。 4.初步探索了长牡蛎类A型HBGA的结构。将F1和F2组分进行SDS-PAGE分离及Western Blot验证，发现长牡蛎类A型HBGA的分子量大于180kDa，且其与人A型HBGA的分子量存在明显的差异，表明长牡蛎类A型HBGA与人A型HBGA的结构可能存在一定的差异性；对长牡蛎类A型HBGA的SDS-PAGE条带进行MALDI-TOF-TOF-MS分析，通过Mascot2.3分析软件分析所得数据，结果显示有两种匹配蛋白，20条多肽序列，其中3条肽段的可信度单独超过 scores值，其多肽序列为 VYDLEFVFDYRDDYAR， DNPEQPDIPELPTETFVVNR和AQSIEDTNSEGPVVQDTALAVLR；对YY1组分进行红外光谱、GC/MS及单糖组成分析，表明YY1样品中可能存在一种多糖结构与人类A型HBGA的多糖结构相同，但其单糖组成的种类较多，组分繁杂，仍需进一步优化条件并分离纯化。
NETL