摘要
南极鱼类常年生活在-1.9℃的南大洋中，目前已知鱼体适应这种低温的一个机制是进化出了抗冻糖蛋白（antifreeze glycoproteins,AFGPs），而南极鱼卵被产在海水中，无AFGPs的保护，那么南极鱼卵在这种低温环境下是如何存活的呢？卵壳蛋白（zona pellucida,ZP）是一类识别精卵结合的蛋白，已有研究表明，南极鱼Notothenioids亚目鱼类ZP基因发生了大量扩增，可能与南极鱼适应极端寒冷水域有关。本实验室前期研究发现，卵壳蛋白ZPC5（zona pellucida c5,ZPC5）在南极鱼卵巢中大量表达，但是其具体功能尚不清楚。实验室前期研究从鳞头犬牙南极鱼的卵巢中克隆得到了三种DmZPC5基因（Dissostichus mawsonizona pellucida c5,DmZPC5），分别命名为DmZPC5_1(zona pellucida protein ZPC5 isoform1)、DmZPC5_2(zona pellucida protein ZPC5 isoform2)、DmZPC5_3(zona pellucida protein ZPC5 isoform3)，且编码的蛋白质长度逐渐缩短。为了明确DmZPC5是否参与鱼类抗冻过程及其低温下分子调控机制，本研究在中国仓鼠卵巢细胞（Chinese Hamster Ovary,CHO）中过表达DmZPC5，随之给予CHO细胞一定程度的低温处理，通过统计CHO细胞的存活率，来探讨DmZPC5在鱼类抗冻过程中的作用。本研究结果表明，DmZPC5有可能参与南极鱼鱼卵抗冻过程。具体结果如下： 1)将从实验室获得的DmZPC5重组质粒进行测序鉴定，测序结果表明，三种DmZPC5基因编码区全长分别为1629bp、1482bp、1389bp，其所编码的氨基酸数目分别为543、494、463。 2)重组质粒双酶切电泳结果显示，DmZPC5_1、DmZPC5_2、DmZPC5_3基因重组质粒载体经双酶切电泳后，均有两条对应的电泳条带，表明目的基因均正确插入到pIRES2-EGFP载体上。 3) Western Blot检测结果显示，目的蛋白DmZPC5_1、DmZPC5_2、DmZPC5_3均能在CHO细胞中高效表达，0℃低温处理后，CHO细胞内的DmZPC5的蛋白表达量明显高于37℃培养，表明了低温下DmZPC5的稳定性与温度相关，即外源蛋白DmZPC5在低温下更稳定。 4)存活率检测结果发现，过表达DmZPC5的CHO细胞在0℃处理16 h后，其存活率较对照组显著上升（P＜0.001），-2℃处理4h、8h后，存活率也均较对照组显著上升（P＜0.01），证明DmZPC5在低温下可以促进细胞的存活。并且DmZPC5_1、DmZPC5_2、DmZPC5_3对CHO细胞的存活率影响各不相同，瞬时表达DmZPC5_1蛋白的CHO细胞存活率最低，瞬时表达DmZPC5_3蛋白的CHO细胞存活率最高。 5)对低温处理的CHO细胞进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，结果表明，外源性蛋白DmZPC5_1在0℃低温处理后，蛋白聚合体明显上调，而DmZPC5_2、DmZPC5_3均无蛋白聚合体的产生，仅有蛋白单体量明显上调，这可能与其在低温下对CHO细胞的存活率差异有关。 总而言之，本研究通过对瞬转DmZPC5的CHO细胞进行低温胁迫处理，探讨了CHO细胞内DmZPC5_1、DmZPC5_2、DmZPC5_3的蛋白表达量变化以及CHO细胞在低温下存活率。第一方面，低温下，CHO细胞中DmZPC5蛋白表达量较37℃高，有可能外源性DmZPC5蛋白在低温下更稳定；第二方面，低温（-2℃）处理后，CHO细胞的存活率较对照组显著上升，这个低温处理的温度与南极水域的温度相近，为我们以后研究南极鱼低温适应的分子机制提供一个很好的基础；第三方面，DmZPC5_1、DmZPC5_2、DmZPC5_3在低温下表现出的蛋白特性各异，这为后期研究南极鱼的低温适应化进化奠定了基础。
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