摘要
肿瘤多药耐药（multi-drug resistance,MDR）成为肿瘤化疗失败的重要原因，而ATP结合盒（ATP binding cassette,ABC）转运家族蛋白的高表达引起的药物外排增加是导致肿瘤MDR的主要原因之一，因此，研发针对ABC转运蛋白介导的多药耐药逆转剂成为克服肿瘤MDR的有效手段。然而，目前针对ABC转运家族蛋白的三代逆转剂由于其专属性低、毒性大以及体内亲和力小等原因均未能成功上市。近年来，从中药中筛选出高效低毒的耐药逆转剂及先导化合物已经成为肿瘤MDR研究的热点。 钩藤生物碱是从临床常用中药钩藤中分离得到的生物碱类成分，其中钩藤碱（Rhynchophylline,Rhy）、异钩藤碱（Isorhynchophylline,Irhy）、去氢钩藤碱（Corynoxeine,Cory）和异去氢钩藤碱（Isocorynoxeine,Icory）是钩藤氧化类吲哚生物碱中的主要单体成分，而毛钩藤碱（Hirsutine,HT）和去氢毛钩藤碱（Hirsuteine,HST）是钩藤非氧化类吲哚生物碱中的主要单体成分。有研究报道钩藤生物碱提取物及其单体成分具有抑制多种肿瘤细胞增殖以及促进肿瘤细胞凋亡等活性，但在钩藤生物碱逆转肿瘤多药耐药方面的报道甚少。本研究发现以氧化吲哚生物碱为主的钩藤生物碱提取物（U1）和以非氧化吲哚生物碱为主的钩藤生物碱提取物（U2）及其六个单体成分均具有逆转肿瘤多药耐药活性，并选取毒性较小且逆转活性最佳的异去氢钩藤碱（Icory）为主要研究对象，对钩藤生物碱逆转肿瘤多药耐药机制进行深入研究。 目的：对钩藤生物碱逆转肿瘤多药耐药活性进行评价，筛选出活性较好的单体成分Icory为主要研究对象，进行进一步的耐药活性评价，并对其作用机制做深入研究，以期为将钩藤生物碱开发成为肿瘤多药耐药逆转剂或先导化合物提供科学依据。 方法： 1.对钩藤生物碱逆转肿瘤多药耐药活性的评价： （1）采用MTT法分别确定U1、U2、Rhy、Irhy、Cory、Icory、HT和HST在HepG2细胞和HepG2/ADM细胞上的非毒剂量； （2）采用MTT法对U1、U2和六个单体化合物进行肿瘤多药耐药逆转活性的初步评价，并筛选出逆转活性最佳的钩藤生物碱单体成分； （3）采用MTT法在ABCB1高表达细胞株及其敏感细胞株上进一步对Icory的逆转活性进行评价； （4）采用MTT法分别在ABCC1和ABCG2高表达的细胞株及其敏感细胞株上对Icory的逆转活性进行评价； 2.对钩藤生物碱逆转肿瘤多药耐药机制的研究： （1）通过荧光酶标仪及荧光拍照检测Icory对多柔比星（Doxorubicin,DOX）在耐药细胞内累积的影响； （2）通过荧光酶标仪检测Icory对耐药细胞外排DOX的影响； （3）采用qPCR和Western Blot法检测Icory对ABCB1在mRNA和蛋白表达的影响； （4）通过Pgp-GloTM ATPase试剂盒检测Icory对ABCB1 ATPase活性的影响； （5）运用MTT法检测Icory耐药逆转活性的持续性； （6）采用Docking分子对接的方法预测分析Icory和ABCB1的结合方式和结合位点。 结果： 1.U1、U2、Rhy、Irhy、Cory、Icory、HT和HST均具有逆转肿瘤多药耐药活性，其中Icory的逆转作用最强； 2.Icory能够增加HepG2/ADM和MCF-7/ADR等ABCB1高表达细胞对DOX，长春新碱（Vincristine, VCR）和紫杉醇（Paclitaxel）等ABCB1底物的抗肿瘤药物的敏感性，但不增加ABCB1高表达细胞株对非ABCB1底物顺铂（Cisplatin）的敏感性； 3.Icory不能增加ABCC1高表达细胞株HEK293/MRP1和ABCG2高表达细胞株S1-M1-80对抗肿瘤药物的敏感性； 4.Icory能够增加DOX在HepG2/ADM和MCF-7/ADR细胞内的累积； 5.Icory能够抑制HepG2/ADM细胞对DOX的外排作用； 6.Icory对ABCB1的表达量无明显影响； 7.Icory能够刺激ABCB1 ATPase的活性； 8.Icory的逆转作用依赖于其浓度，不具有持续性； 9.Icory占据ABCB1底物的重要结合位点，且和VRP与ABCB1的结合位点部分重叠。 结论：钩藤生物碱具有逆转肿瘤多药耐药活性，Icory能够特异性逆转ABCB1介导的肿瘤多药耐药，而对ABCC1和ABCG2介导的肿瘤多药耐药无明显逆转作用；Icory不影响ABCB1的表达量，而是通过激活ABCB1 ATPase，竞争性的抑制ABCB1的泵出功能，减少抗肿瘤药物的外排，增加细胞内药物的累积，进而发挥其逆转作用。
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