摘要
本文从以下几个方面进行论述： 第一部分 草酸钙肾结石患者肾脏中自噬的变化和作用研究 目的: 观察草酸钙肾结石患者肾脏中自噬水平的变化，探讨自噬在草酸钙肾结石形成中的作用。 方法: 收集28例草酸钙肾结石患者肾乳头及其周围间质组织标本作为实验组，同期收集12例行根治性肾切除病人的肾脏，切取远离肿瘤的正常组织标本作为对照组。应用结石红外光谱自动分析系统分析肾结石患者的结石成分。HE染色观察草酸钙肾结石患者肾组织的病理变化及肾脏中晶体的沉积情况。通过Western blot和免疫组化技术检测自噬关键蛋白LC3-Ⅱ、BECN1与p62的表达情况。利用透射电子显微镜观察草酸钙肾结石患者肾组织中自噬泡的形成过程及数量变化。 结果: 1.经结石红外光谱自动分析系统分析得出，肾结石患者的结石成分主要为—水草酸钙。 2.与正常对照组相比，结石组HE染色结果可见肾小管管腔扩张、肿胀，管腔内可见坏死物质或脱落的上皮细胞，并伴有晶体沉积。 3.与正常对照组相比，Western blot和免疫组化检测结果得出，草酸钙肾结石患者肾组织中的自噬关键蛋白LC3-Ⅱ和BECN1的表达水平显著升高，p62蛋白表达水平显著下降(P＜0.01)。 4.在结石组中，透射电镜可观察到典型的自噬体和自噬溶酶体结构。与正常组相比，结石组可见肾组织内线粒体明显肿胀，自噬泡的数量显著增多(P＜0.01)。 结论:在草酸钙肾结石患者的肾脏中自噬水平明显增加，其可能在草酸钙肾结石的形成过程中发挥了重要作用。 第二部分 自噬在草酸钙晶体所致肾小管上皮细胞损伤中的效应及机制研究 目的: 观察草酸钙晶体干预肾小管上皮细胞后是否可以激活自噬的发生，探讨草酸钙晶体介导的ROS激活自噬的机制，阐明自噬在草酸钙晶体所致肾小管上皮细胞损伤中的调控作用。 方法: 建立草酸钙晶体-肾小管上皮细胞干预体系的细胞模型，即用不同浓度的草酸钙晶体(0，0.1，0.25，0.5，1.0，2.0，4.0 mM)干预肾小管上皮细胞24h和4.0 mM CaOx晶体干预肾小管上皮细胞不同的时间点(0，2，4，8，12，24h)后，通过Western blot技术检测各组中自噬关键蛋白LC3-Ⅱ、BECN1与p62的表达情况。利用Lipo3000脂质体将带有GFP-LC3的质粒转染到HK-2细胞内，通过共聚焦显微镜观察不同浓度的草酸钙晶体干预肾小管上皮细胞24h后，自噬体的形成情况。透射电子显微镜观察4.0 mM CaOx晶体干预肾小管上皮细胞24h后，细胞内自噬体与自噬溶酶体的典型结构及数量。用不同浓度的草酸钙晶体(0，0.25，0.5，1.0，2.0，4.0 mM)干预HK-2细胞24h后，采用超氧化物阴离子Dihydroethidium(DHE)荧光探针检测不同浓度的草酸钙晶体干预肾小管细胞后细胞内ROS水平的变化。应用ROS抑制剂(NAC、catalase)和自噬调节剂（雷帕霉素和3-甲基腺嘌呤）及小分子干扰RNA技术（敲低自噬关键基因BECN1），在4.0 mM CaOx晶体溶液干预HK-2细胞24h后，通过Western blot、共聚焦显微镜、自噬单标质粒(GFP-LC3)和自噬双标腺病毒(Ad-mRFP-GFP-LC3)转染技术，阐明草酸钙晶体介导的ROS激活自噬的机制及对自噬水平的调控作用。通过调节草酸钙晶体-肾小管上皮细胞反应体系中的自噬水平，利用DAPI染色检测细胞凋亡、CCK-8检测细胞活力、试剂盒检测细胞上清液中的LDH的表达水平，从而探讨自噬在草酸钙晶体所致肾小管上皮细胞损伤中的调控作用。 结果: 1.与空白对照组比较，在共聚焦显微镜下，可见GFP-LC3阳性斑点数随着草酸钙晶体刺激浓度的升高而增多，并且呈浓度依赖性增多(P＜0.01)。Western blot检测结果进一步得出:随着CaOx晶体刺激浓度的增加，自噬关键蛋白LC3-Ⅱ、BECN1的表达水平逐渐增加，于4.0 mM时达到高峰，而p62蛋白的表达水平达到最低(P＜0.05)。同时，随着草酸钙晶体干预时间的延长，LC3-Ⅱ、BECN1蛋白的表达逐渐增多，于24h达到高峰，而p62蛋白的表达达到最低(P＜0.05)。在透射电镜下我们进一步得出:与空白对照组相比，在4.0 mM CaOx晶体刺激HK-2细胞24h后，细胞内自噬体和自噬溶酶体的数量明显增加(P＜0.01)。 2.与空白对照组比较，在CaOx晶体干预HK-2细胞24h后，随着刺激浓度的增加，细胞内ROS荧光强度值逐渐升高，并且呈浓度依赖性增加(P＜0.05)。CaOx晶体可以诱导HK-2细胞内GFP-LC3阳性斑点数和自噬关键蛋白LC3-Ⅱ、BECN1表达的增加，应用ROS抑制剂NAC和catalase能够下调CaOx晶体诱导细胞内GFP-LC3阳性斑点数和LC3-Ⅱ、BECN1蛋白的表达，而NAC和catalase本身不影响自噬泡的形成(P＜0.01)。 3.与空白对照组相比，在共聚焦显微镜下可以观察到CaOx晶体干预组细胞内自噬体和自噬溶酶体的数量明显增加（P＜0.001）。与空白对照组相比，雷帕霉素组内自噬体和自噬溶酶体的数量增多，而3-甲基腺嘌呤组则进一步的减少。与CaOx晶体干预组相比，CaOx晶体+Rapa处理组内自噬体和自噬溶酶体的数量明显增加，而CaOx晶体+3-MA处理组则明显减少(P＜0.01)。Western blot检测结果进一步证实:与CaOx晶体干预组相比，CaOx晶体+Rapa处理组自噬关键蛋白LC3-Ⅱ的表达明显增加，而CaOx晶体+3-MA处理组中LC3-Ⅱ蛋白的表达显著降低(P＜0.01)。 结论: 1.明确了草酸钙晶体诱导肾小管上皮细胞产生自噬的最佳浓度和时间点。 2.草酸钙晶体可以诱导肾小管上皮细胞内ROS的产生，进而通过ROS介导自噬的激活。 3.应用自噬诱导剂（雷帕霉素）、抑制剂（3-甲基腺嘌呤）和小分子干扰RNA技术（敲低自噬关键基因BECN1），能够对草酸钙晶体激活肾小管上皮细胞内的自噬水平进行有效地调控。 4.抑制自噬可以有效地减轻草酸钙晶体诱导的肾小管上皮细胞损伤。 第三部分 自噬在大鼠草酸钙肾结石模型中的调控作用及其机制研究 目的: 建立大鼠草酸钙肾结石模型，探讨ROS介导的自噬在大鼠草酸钙肾结石形成过程中的作用。 方法: 采用0.75％乙二醇饮水法诱导建立大鼠草酸钙肾结石模型。采用随机数字表法，将32只健康雄性SD大鼠随机分为4组:正常对照组、结石模型组、结石模型+雷帕霉素组、结石模型+氯喹组，每组8只。干预4周后，应用Western blot检测各组肾组织中自噬关键蛋白LC3-Ⅱ、BECN1与p62的表达情况。透射电镜观察各组肾组织中自噬泡的数量;免疫组化检测各组肾组织中自噬关键蛋白LC3-Ⅱ的表达水平。32只健康雄性SD大鼠随机分为4组:正常对照组、NAC处理组、结石模型组、结石模型+NAC组，每组8只。干预4周后，应用试剂盒检测各组24h尿液中T-SOD和GSH-PX的表达水平;应用Western blot和免疫组化检测各组肾组织中自噬关键蛋白LC3-Ⅱ的表达水平;通过电镜观察各组肾脏中的自噬泡数量。使用代谢笼收集大鼠24h尿液，通过ELISA试剂盒检测各组尿液中NGAL和Kim-1的表达水平;收集大鼠血液，应用全自动生化仪检测各组血清肌酐及尿素氮的水平;TUNEL法检测各组肾小管细胞的凋亡情况;Von Kossa硝酸银法检测各组肾脏晶体的沉积情况及肾组织的病理学变化。 结果: 1.与正常对照组相比，Western blot检测显示:结石模型组中自噬关键蛋白 LC3-Ⅱ和BECN1的表达增加，而p62蛋白的表达水平下降(P＜0.05);免疫组化结果提示:自噬关键蛋白LC3-Ⅱ的表达水平升高。通过透射电镜可以观察到自噬泡的数量明显增多(P＜0.01)。与结石模型组相比，结石模型+氯喹组中自噬泡的数量和自噬关键蛋白LC3-Ⅱ、BECN1、p62的表达水平明显增加(P＜0.05)。与结石模型组相比，结石模型+雷帕霉素组中自噬泡的数量和自噬关键蛋白LC3-Ⅱ、BECN1的表达水平明显增加，而p62蛋白的表达水平明显下降(P＜0.05)。 2.与结石模型组相比，结石模型+NAC组中自噬泡的数量和自噬关键蛋白LC3-Ⅱ表达水平均下降(P＜0.01)。与正常组相比，结石模型组中T-SOD和GSH-PX表达降低(P＜0.01)。与结石模型组相比，结石模型+雷帕霉素组中T-SOD和GSH-PX活性下降，而NAC处理组和氯喹处理组中GSH-PX和T-SOD活性增高(P＜0.05)。 结论: 1.采用0.75％乙二醇的饮水法能够成功诱导建立大鼠草酸钙肾结石模型。 2.乙二醇能够诱导大鼠肾脏内ROS的产生，进而可以通过ROS介导自噬的激活。 3.应用自噬诱导剂（雷帕霉素）和抑制剂（氯喹）能够有效地调节乙二醇诱导的大鼠草酸钙肾结石模型中肾脏内的自噬水平。 4.ROS介导的自噬可以促进乙二醇诱导的大鼠草酸钙肾结石形成，而抑制自噬则能够有效地降低乙二醇诱导的肾脏损伤和晶体沉积，从而减少肾结石的形成率。
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