摘要
肺癌目前是我国乃至全球发病率和病死率均较高的恶性肿瘤之一，严重威胁人类的生活质量和生命健康。我国第三次人口死亡原因的抽样调查中发现与过去30年的肺癌死亡率相比已经上升了465％。另外还有最新数据显示我国的肺癌发病率高达35.23/100000，死亡率高达27.93/100000，已经是我国死亡率最高的恶性肿瘤。肺癌主要是由小细胞肺癌(Small Cell Lung Cancer，SCLC)和非小细胞肺癌(Non-small Cell Lung Cancer，NSCLC)组成，而NSCLC占80％的比重。尤其值得注意的是约70％的确诊肺癌患者均为局部晚期或已经发生远端的转移，因此化疗在目前的临床治疗中就显得非常重要，在延长患者的生存时间，提高其生活质量方面具有重要的意义。多西他赛(docetaxel，DTX)作为第三代化疗新药，是治疗非小细胞肺癌重要的一线和二线药物，是作用于微管的抗肿瘤药物，具有显著的抗肿瘤作用，在临床上广泛用于乳腺癌、NSCLC、卵巢癌等的治疗。它能够促进细胞微管蛋白聚合并抑制微管解聚，导致微管动力学调节异常，激活纺锤体组装检验点，阻断细胞正常有丝分裂，使细胞周期阻滞于G2/M期，进而引起细胞凋亡。但是，多西他赛易耐药在很大程度上影响了其治疗。 至今为止已经发现多个Cullin-RING E3泛素连接酶复合物的支架蛋白，而Cullin7(Cu17)便是其重要成员之一。研究显示，Cu17与多种恶性肿瘤的发生发展密切相关，研究报道3-M综合征相关互不相交的突变基因(Cu17、OBSL1、CCDC8)以及FBXW8能形成3M复合体，3M复合体通路以及下游分子Cu19对保持细胞微管和基因组完整性具有重要的作用。Cu17的异常表达可以导致微管动力学紊乱，组织有丝分裂和胞质分裂。敲低Cu17能够增强肺癌细胞对非毒性剂量紫杉醇的敏感性。和其他研究人员发现，Cu17在NSCLC组织中高表达，能够促进NSCLC细胞增殖，侵润和转移。在NSCLC的多西他赛耐药细胞株中已经观察到了Cu17高表达。但是目前还没有关于Cu17与肿瘤耐药相关的报道，其耐药机制也尚不清楚。 目的: 本课题拟研究Cu17在NSCLC多西他赛耐药中的作用。在亲本细胞中敲低和过表达Cu17后检测其对多西他赛药物敏感性的变化，鉴定Cu17与多西他赛耐药的相关性以及其可能的分子机制，为阐明NSCLC耐药分子机制提供新的线索，也将为临床肿瘤多西他赛耐药的干预策略提供新的思路。 方法: 1.应用MTS的方法检测计算实验室NSCLC细胞及其由美国密歇根大学Max Wicha教授实验室提供的相对应的多西他赛耐药细胞的半数抑制浓度(IC50)和耐药倍数。 2.运用Real-time PCR、Western Blot免疫印迹和免疫荧光的方法检测Cu17在NSCLC亲本和耐药细胞中的表达以及定位情况。 3.使用流式细胞术检测相同多西他赛加药浓度下NSCLC亲本和耐药细胞凋亡情况和周期变化的不同。在NSCLC亲本细胞中逐渐增加依托泊苷和多西他赛的加药浓度，并用Westem Blot免疫印迹检测Cu17蛋白的表达变化。 4.质粒介导构建Cu17shRNA干扰A549、H358、H1299、A549DTX和H358DTX细胞中Cu17的表达。使用真核细胞载体pCDNA3-HA-Cu17，采用脂质体Lipofectamine2000转染A549和H1299细胞，过表达Cu17。运用Real-time PCR、Western Blot免疫印迹技术检测其干扰以及过表达的效率。 5.应用MTS的方法检测干扰和过表达Cu17的细胞A549和H1299对多西他赛和依托泊苷药物敏感性的变化。 6.通过Western Blot免疫印迹检测A549、A549DTX、A549shNeg、A549shCu17、A549pCDNA3和A549HACu17等细胞中Cu17和Survivin的表达变化。通过运用免疫组化技术来验证非小细胞肺癌组织中Cu17和Survivin的表达。 7.使用SiRNA瞬时敲低H1299DTX和H1299HACu17细胞中Survivin，并通过Real-time PCR和Western Blot免疫印迹的方法检测干扰效率。用MTS的方法检测转染后H1299DTX和H1299HACu17细胞对多西他赛药物的敏感性。 结果: 本研究中使用MTS方法检测NSCLC亲本细胞A549、H358及其对应的多西他赛耐药A549DTX、H358DTX的IC50，得到其稳定耐药倍数分别约为18倍和11倍。与亲本细胞相比，在耐药细胞中，Cu17在蛋白和mRNA水平均呈现高表达，免疫荧光显示其在胞核和胞浆均有表达，但在胞核中高表达。流式细胞术结果显示相同多西他赛加药浓度下，耐药细胞凋亡明显少于亲本细胞（P＜0.05）。敲低或过表达A549、H1299细胞中的Cu17，肿瘤细胞对多西他赛、紫杉醇和依托泊苷的药物敏感性分别呈现增强或降低的趋势(P＜0.05)。在A549DTX、H358DTX中敲低Cu17后，细胞对多西他赛的敏感性明显增强(P＜0.05）。Western Blot免疫印迹检测发现在NSCLC多西他赛耐药细胞中Cu17和Survivin均有高表达，在亲本细胞中敲低或过表达Cu17，Survivin也会随之下调或上调。在H1299DTX和H1299HACu17细胞中瞬时沉默Survivin，发现肿瘤细胞对多西他赛的敏感性增强(P＜0.05)。在本研究中，还发现敲低Cu17的A549DTX细胞中Caspase3没有明显的变化，Cleaved-Caspase3发生明显的上调，而在敲低Cu17的H358DTX细胞中可以看出Cleaved-Caspase3也有一定程度地上调，但是不太明显。 结论: Cu17在多西他赛耐药的NSCLC细胞中高表达，参与NSCLC多西他赛耐药的形成。而这一耐药机制可能是Cu17通过上调了下游的Survivin蛋白，抑制细胞凋亡来实现的。
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