摘要
肠道病毒(Enterovirus，EV)是小核糖核酸(Ribonucleic Acid,RNA)病毒目（Picornavirales）小RNA病毒科（Picornaviridae）肠道病毒属（Enterovirus)中最常见的人类病原体之一，目前分为12个组，分别为肠道病毒A～H，J和鼻病毒A～C。EV在自然界中广泛存在，多数血清型都能够感染人类并可引起多种疾病。尽管人体感染EV后通常无明显的临床症状，但部分感染病例可出现急性弛缓性麻痹(Acute Flaccid Paralysis，AFP)、手足口病(Hand，Foot and Mouth Disease，HFMD)、无菌性脑膜炎(Aseptic Meningitis，AM)、急性出血性结膜炎(Acute Hemorrhagic Conjunctivitis，AHC)、疱疹性咽峡炎、心肌炎、Ⅰ型糖尿病、流行性肌痛等，严重者可导致死亡。EV-A所致疾病以手足口病最为常见，多发于5岁以下婴幼儿，可引起发热和手、足及口腔部位的皮疹、溃疡等。在手足口病的病原谱中，肠道病毒71型(EV-A71)和柯萨奇病毒A组16型(Coxsackievirus A16，CV-A16)是导致该疾病暴发和流行的两大主要病原体。 EV基因组为单股正链RNA，包括5'端非转录区(5'-Nontranslated Region，5'-NTR)、编码多聚蛋白的单一开放阅读框(Open Reading Frame，ORF)和3'-NTR共3个部分，全长约7.5kb。单一的ORF编码的多聚蛋白包括4个衣壳结构蛋白(VP1～VP4)和7个非结构蛋白（2A-2C和3A-3D）。其中，VP1蛋白位于病毒衣壳的最外侧，在病毒抗原性和致病性等方面发挥重要作用。目前，根据EV完整或部分VP1序列的分子生物学定型方法得到广泛应用，该方法通过对VP1核苷酸序列扩增后测序，并进一步与其他已知血清型别进行序列比对实现EV血清型别鉴定。近些年，基于VP1序列的系统发生学分析被认为是开展EV分子流行病学研究及进化分析的可靠方法，并用于相关变异株及新型EV的鉴定。 在EV基因重组与进化研究方面，基于贝叶斯理论的BEAST程序，可以对病毒的起源和进化速度等参数进行详细计算分析，初步应用于EV的进化起源研究中。运用贝叶斯的马尔可夫链蒙特卡尔(Markov Chain Monte Carlo，MCMC)方法，能够对EV不同血清型的进化遗传学特征（如基因序列起源、进化速度、流行史重构、居群动力学特征等）进行分析。此外，系统发生生物地理学(Phylogeography)是将研究对象不同来源的信息与相关序列数据结合在一起进行进化重建分析的过程，这种分析方法在模拟各种传染病传播及流行史重构研究中得到广泛应用。目前，系统发生生物地理学分析多用于物种进化历史及地理迁移信息的重建。在传染病研究中，则更多地集中于模拟虫媒传播疾病的时空扩散。对EV开展系统发生生物地理学特征分析并利用BEAST软件的贝叶斯随机搜索变量选择(Bayesian Stochastic Search Variable Selection，BSSVS)模型开展EV系统发生生物地理学特征分析，能够初步探索不同血清型别EV在不同地域间的时空演变过程。 EV-A涵盖近25个血清型别，其中EV-A71、CV-A16等多个型别曾在世界范围内引起相关疾病的暴发流行。由于目前全球EV-A毒株数量较少，EV-A多数血清型的分子流行病学特征研究仍存有一定的局限性。山东省疾病预防控制中心(CDC)在过去近30年里积累了丰富的EV-A分离株，并且所有毒株均具有完整翔实的毒株信息。因此，现阶段对EV-A开展较为深入的分子流行病学研究，并在此基础上进行深入的进化遗传学研究和系统发生生物地理学研究，对于EV所致相关疾病的机制及预防控制将具有重要的理论和实际意义。 研究目的: 1.探索EV-A不同血清型山东株在山东省内的时间循环模式及其与疾病的关系。 2.构建并完善EV-A山东株12个血清型(CV-A2、CV-A4、CV-A5、CV-A6、CV-A8、CV-A10、CV-A12、CV-A14、CV-A16、EV-A71、EV-A76和EV-A90)毒株VP1区和3D区基因数据库，并对以上血清型毒株进行基因特征研究。 3.分析EV-A山东株基因重组的发生，探讨病毒遗传变异对其致病性和流行规律的影响。 4.基于贝叶斯理论的MCMC分析方法，分析EV-A山东株的进化遗传学特征（基因序列起源、进化速度、重构流行史、居群动力学等）。 5.根据贝叶斯BSSVS模型探讨EV-A的系统发生生物地理学特征，分析EV-A不同血清型的时空动态传播过程。 研究方法: 1.毒株分离:本研究所选毒株来自山东省CDC1989～2016年分离到的EV-A毒株。病毒株于-80℃低温冰柜冷冻保存，实验前接种RD或Hep-2细胞进行病毒增殖。 2.病毒RNA提取:采用美国QIAGEN公司的QIAamp Viral RNA Mini Kit试剂盒，从140μl细胞培养物中提取50μl病毒RNA，加1μl(40U)Rnasin(QIAGEN)后储存于-80℃。 3.RT-PCR及基因测序:RT-PCR采用美国Promega公司Access RT-PCRSystem试剂盒扩增VP1和3D区基因片段，RT-PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳，对阳性产物进行序列测定。 4.型别鉴定:EV型别鉴定采用基于VP1序列的分子学定型方法，使用NCBI在线提供的BLAST程序与数据库序列进行比对，确定EVA山东株的血清型别。 5.生物信息学分析:使用MEGA6.0软件，进行系统进化分析，探讨EV-A山东株基因重组情况。通过BEAST1.8.3软件分析EV-A山东株进化遗传学特征，使用贝叶斯天际线图开展居群动力学特征分析。采用贝叶斯BSSVS模块对EV-A时空动态传播过程进行估计，并在SPREAD1.0.6软件中模拟EV-A的溯源及时空动态关联。 研究结果: 1.EV-A山东株血清型分布:通过EV分子生物学定型方法对1989～2016年分离自山东省AFP及相关病例标本的EV-A山东株进行型别鉴定，共鉴别出EV-A山东株251株，涵盖12个EV血清型别(CV-A2、CV-A4、CV-A5、CV-A6、CV-A8、CV-A10、CV-A12、CV-A14、CV-A16、EV-A71、EV-A76和EV-A90)。其中，EV-A71、CV-A4、CV-A10、CV-A16、CV-A6、CV-A2等6个血清型在山东省历年EV监测中共分离到237株，为EV-A山东株优势血清型别。自2008年以来，EV-A在山东省内流行活跃，共分离到223株，占EV-A山东株的88.8％。 2.EV-A山东株分子进化及基因重组分析:本研究共选取251株EV-A山东株进行VP1和3D区序列系统进化和基因重组分析。构建VP1区系统进化树发现，山东省12个EV-A血清型毒株在进化树上根据遗传关系远近的不同聚为不同的分支，未发现EV-A山东株在VP1区重组的证据。EV-A不同血清型毒株在山东省的流行具有时间动力学特征，即不同年代的EV-A分离株在系统进化树中位于不同的进化分支。 通过构建EV-A山东株3D区系统进化树发现，山东分离株在非结构蛋白区存在频繁的基因重组现象。按照EVA山东地方株在进化树中亲缘关系的远近，我们将EVA山东株在3D进化树上进一步分为10个基因簇(1～10)。 (1)3D区系统进化树显示，每个基因组所包含山东株血清型别不尽相同，而且同一型别的山东分离株在3D进化树中分处不同的基因组。EV-A山东株3D编码区不同基因组优势山东株的分离时间也不完全相同，其最长分离时间跨度为25年，各基因组平均分离时间跨度约为10年（10.4±7.6年）。 (2)基因簇1包含毒株分离自2003～2015年，其中除1株CV-A12山东株(F424)外，其余毒株均为EV-A71。基因簇2的病毒成员分离自1996～2011年，除包含CV-A4、CV-A14和CV-A16这3个血清型的原型株外，还包含1株CV-A6和5株CV-A12山东株。基因簇3也是山东株3D序列进化树中的优势基因组，山东株分离时间跨度为1992～2015年，由CV-A2、CV-A4、CV-A6、CV-A10、CV-A14等4个血清型的山东株组成。基因簇10由EV-A76和EV-A90两个型别的山东株组成，EV-A76血清型为1株2005年分离到的毒株，其余4株EV-A90为1999～2003年分离获得。 3.EV-A优势血清型进化起源分析:本研究所选CV-A2、CV-A4、CV-A6、CV-A10、CV-A16和EV-A71等6个EV-A优势血清型毒株的祖先分别起源于1925年、1944年、1946年、1904年、1905年和1936年。近10年以来，EV-A优势血清型山东株VP1区遗传多样性增大。不同EV-A血清型VP1区核苷酸序列每年每个碱基位点的平均进化速度为2.615×10-3～6.431×10-3，其中EV-A71平均进化速度最低，而CV-A4VP1区平均进化速度最高。此外，同一血清型不同分支毒株的VP1区平均进化速度不同。EV-A优势血清型山东株在进化起源上与来自中国其他省份分离株存在共同的进化祖先。 4.EV-A优势血清型时空动态传播分析:近些年，EV-A在全球范围内的传播速度明显加快。基于现有基因序列分析发现，除CV-A16在全球范围内的传播最先起源于南非共和国外，全球CV-A2、CV-A4、CV-A6、CV-A10和EV-A71的传播可能最初均起源于美国。EV-A优势血清型最先起源的传播分支已“静默”多年，目前全球CV-A2、CV-A4、CV-A6、CV-A10、CV-A16和EV-A71的流行多集中分布在亚洲-太平洋地区和欧洲地区。EV-A的时空传播具有明显的地域特征，表现为同一地域内的传播要优先于不同地域间的传播。 研究结论: 1.山东省EV监测中发现多种EV-A血清型，其中以EV-A71、CV-A4、CV-A10、CV-A16、CV-A6、CV-A2等6个血清型为主。本研究共分离到251株EV-A山东分离株，分属12个血清型，即CV-A2、CV-A4、CV-A5、CV-A6、CV-A8、CV-A10、CV-A12、CV-A14、CV-A16、EV-A71、EV-A76、EV-A90。分离自AFP监测系统的毒株涵盖上述所有血清型别;来自HFMD病例的毒株型别以EV-A71和CV-A16为主;AM病例的感染毒株以EV-A71为主;感染疱疹性咽峡炎病例的EV-A血清型别主要为CV-A10和CV-A6。 2.EV-A山东分离株与国外分离株具有较大的核苷酸差异，基因重组是EV-A非结构蛋白区重要的进化方式。EV-A山东分离株在进化关系上具有一定的时间聚集性和空间聚集性，与国外分离株亲缘关系较远。构建3D区系统进化树发现，EV-A山东株非结构蛋白区基因片段转移频繁，存在频繁的基因重组现象。EV-A山东株在进化树中分为10个基因簇，每个基因簇所包含山东株血清型种类和数量不同，同一血清型山东株分处不同的基因组。 3.EV-A山东株优势血清型VP1区遗传变异活跃，山东省存在多个传播链的共同流行。系统发生生物地理学分析发现，EV-A优势血清型的共同祖先起源于1904～1946年间，VP1区每年每个碱基的平均进化速率为2.6×10-3-6.4×10-3，并且同一血清型不同分支的进化速度并不一致。 4.EV-A时空动态传播具有一定的地域性特征，近些年来传播速度明显加快。根据现有基因序列分析，多数EV-A血清型毒株可能起源于美国，而目前EV-A流行区域多集中在亚洲-太平洋地区和欧洲地区。 5.建议我国加强对EV-A各血清型的监测，开展系统的分子流行病学研究工作。鉴于EV-A毒株在世界范围内流行日趋活跃，我国近些年EV所致疾病更为严重，理应加强EV病原学、流行病学等系统的研究工作，以期为EV所致疾病的实验室检测方法的建立、疫情预测预警和疫苗的研发等防控措施提供科学依据。
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