摘要
当前，恶性肿瘤仍然是全球范围内严重威胁人类生命健康的一大疾病，在临床上，化学治疗依然是肿瘤的主要治疗手段。然而，大多数化疗药物存在水溶性低，稳定性不佳，对肿瘤组织缺乏选择性等问题，导致肿瘤的化疗往往难以取得理想的效果，治疗过程中常伴随有严重的毒副作用。此外，研究人员难以在肿瘤的治疗过程中对疗效进行实时的评估，无法及时调整治疗方案。因此，目前亟需构建一种新型的纳米给药体系，该体系既能高效地杀伤肿瘤，又具有诊断功能，能够在治疗的过程中实时监控疗效。 基于此，本课题设计了一种新型的多功能环境响应型智能药物递送系统。该体系既可以对肿瘤细胞内的还原条件做出迅速的响应，快速、彻底地释放出药物，从而提高化疗疗效，又可以实现肿瘤的光动力治疗，从而通过联合治疗模式增强抑瘤效果。此外，该体系还具有NIR（近红外）成像功能，可以在治疗的同时对疗效进行实时的监测，从而实现诊治一体化的目的。 本研究主要分为两大部分。第一部分构建了以胱胺为连接臂的维生素E琥珀酸酯-低分子肝素聚合物(Hep-cys-TOS)，并将该聚合物用于模型药物紫杉醇(PTX)的包载，同时也将己二酸二酰肼(ADH)用作连接臂，合成了非还原敏感型低分子肝素-己二酸二酰肼-维生素E琥珀酸酯(Hep-ADH-TOS)聚合物，从而用于非敏感型纳米体系的构建。研究发现Hep-cys-TOS纳米粒具有良好的还原响应行为，并且相比于非敏感型Hep-ADH-TOS纳米粒，能够更有效地杀死肿瘤细胞。以上结果提示本课题提出的智能型纳米粒的构建方法合理，能够切实增强化疗效果，可以为多功能纳米体系的构建提供依据与实验基础。 本研究的第二部分沿用了第一部分的设计思路，仍然选择胱胺作为连接臂，将光敏剂二氢卟吩e6(Ce6)接枝于低分子肝素上。为了使该纳米体系可以有效地包载模型药物PTX，TOS仍作为PTX储库被引入该体系，并最终合成了以胱胺为连接臂的Ce6-低分子肝素-维生素E琥珀酸酯（Ce6-Hep-TOS，CHT）聚合物。由于PTX的存在，该体系可以用于肿瘤的化疗;由于Ce6的加入，该体系具有光动力治疗活性以及NIR成像能力。综上，该载体成功实现了触发式释药、肿瘤诊断、化疗和光动力治疗的整合。 本研究的主要研究方法和结果如下: 1.低分子肝素-TOS聚合物(Hep-cys-TOS和Hep-ADH-TOS)的合成和表征 分别以胱胺和ADH为连接臂，通过两步酰胺化反应，合成了还原敏感性聚合物Hep-cys-TOS和非还原敏感性聚合物Hep-ADH-TOS。在不同的TOS和低分子肝素的投料比下，合成了三种Hep-cys-TOS聚合物(Hep-cys-TOS1，2，3)，其TOS取代度分别为1.72，3.48和6.95。通过1H-NMR和FT-IR证明聚合物的成功合成。 2.Hep-cys-TOS聚合物纳米粒的制备和体外评价 聚合物的临界聚集浓度(CAC)测定结果表明，随TOS取代度的增大，Hep-cys-TOS聚合物的CAC值从0.093mg/mL降低到0.026mg/mL。并且Hep-ADH-TOS的CAC值为0.050mg/mL。分别以Hep-cys-TOS1-3为原料，采用超声法制备不载药的空白纳米粒，其粒径大小在127.7±2.2～212.6±9.8nm范围内，zeta电位在-16.17±2.21到-8.53±0.99mV之间。 选用Hep-cys-TOS2聚合物作为载体材料，对难溶性的模型药物PTX进行物理包载，制备PTX/Hep-cys-TOS纳米粒，发现药质比和水相/有机相体积比均会影响聚合物的载药能力;当药质比为36∶80(w∶w)，甲醇/PBS体积比为3∶0.375时，可得到载药量最大的处方（载药量:18.99±0.85％，包封率:52.93±2.06％）。 考察最优处方下PTX/Hep-cys-TOS纳米粒的理化性质:粒径为224nm（多分散系数PDI=0.264）;zeta电位为-26.2mV;TEM图像表明粒子呈圆整球状，大小分布均匀;差示扫描量热(DSC)分析表明PTX被包载于Hep-cys-TOS纳米粒中。 考察Hep-cys-TOS纳米粒的还原敏感性:Hep-cys-TOS纳米粒经20mM DTT孵育后，粒径大小及PDI均会随孵育时间的延长而明显增大;粒子形状变不规则，出现了许多碎片;经20mM DTT孵育的载药纳米粒溶液会变浑浊。用动态膜透析法考察载药纳米粒在不同释放介质的释药行为，发现在含有20mM二硫苏糖醇(DTT)的释放介质中，PTX的释放明显加快。以上结果均表明该体系具有良好的还原响应特性。 细胞摄取实验表明MCF-7细胞可以有效地摄取Hep-cys-TOS纳米粒。摄取机制研究表明MCF-7细胞对Hep-cys-TOS纳米粒的摄取需要消耗能量，胆固醇依赖型的内吞主要参与了纳米粒的摄取，也有部分纳米粒可经过小窝蛋白介导的细胞内吞入胞。 用MTT法考察空白和载药纳米粒的细胞毒性，说明Hep-cys-TOS和Hep-ADH-TOS聚合物对MCF-7和L929细胞都没有明显的毒副作用。对于MCF-7细胞，还原敏感型PTX/Hep-cys-TOS纳米粒的IC50值(0.79μg/mL)低于非还原敏感型PTX/Hep-ADH-TOS纳米粒（1.11μg/mL），说明还原敏感型的释药模式有利于增强纳米体系的细胞毒性。用FITC-AnnexinⅤ/PI双染法进行细胞凋亡实验，结果表明，相比于PTX/Hep-ADH-TOS纳米粒，PTX/Hep-cys-TOS纳米粒可以显著提高MCF-7细胞的晚期凋亡率(p＜0.05)和总凋亡率(p＜0.01)，进一步证实了还原触发式释药行为有利于诱导细胞凋亡，增强制剂的抗肿瘤活性。 3.载紫杉醇(PTX)还原敏感型二氢卟吩e6-低分子肝素-维生素E琥珀酸酯聚合物纳米粒(PTX/CHT纳米粒)的构建及其理化性质考察 利用酰胺化反应将Ce6通过胱胺接枝在Hep-cys-TOS分子上，合成载体材料Ce6-Hep-cys-TOS;通过改变Ce6，TOS与低分子肝素的投料量之比，得到了具有不同Ce6、TOS取代度的CHT聚合物（CHT1-6）。用1H-NMR和紫外分光光度计确证聚合物的合成，并用紫外分光光度法测定聚合物中Ce6含量(1.88％～22.60％)。 用超声法制备空白CHT纳米粒，分别测定CHT1-6纳米粒的粒径大小、zeta电位以及粒子的表观形态。用透析法制备PTX/CHT纳米粒，评价不同CHT聚合物的载药能力以及不同载药处方的稳定性，最终筛选出最优处方:以CHT2为载体材料，药质比为9∶20，载药量为18.80％，包封率为50.32％。考察了最优处方下PTX/CHT纳米粒的理化性质:粒径大小为152.2nm(PDI=0.259);zeta电位为-24.6mV;TEM图像显示粒子呈现较为圆整的球形，粒子间无粘连，分散均匀。 发现在还原条件下孵育的CHT纳米粒形态明显变化，Ce6分子的NIR荧光强度以及单态氧产量得到恢复，说明CHT纳米粒具有比较好的还原响应性。用动态膜透析法研究PTX/CHT纳米粒在不同还原条件下的释药行为，发现在不含二硫苏糖醇(DTT)的释放介质和含有20μM DTT的释放介质中，PTX/CHT纳米粒的释药曲线几乎一致。在这两组中，不到40％的PTX可以在12h孵育后被释放出来，孵育36h后，仅有大约60％的PTX被释放出来。然而当释放介质中含有20mM DTT时，12h后有50.24％的PTX被释放出来，36h后有85.20％的PTX被释放出来。说明PTX/CHT纳米粒有望在体循环中保持稳定而在肿瘤细胞内被还原型物质破坏，从而快速释放出化疗药物。 4.PTX/CHT纳米粒的体内外生物学评价 用共聚焦激光显微镜(CLSM)观察MCF-7细胞对CHT纳米粒和Ce6溶液的摄取情况，发现在相同孵育时间下，CHT纳米粒组细胞荧光强度明显强于Ce6溶液组。用流式细胞术对摄取情况进行定量分析:在1、2、4h孵育后，经CHT纳米粒孵育的MCF-7的平均荧光强度分别比Ce6溶液组高出4.25、4.96、5.12倍。说明相比于Ce6溶液，CHT纳米粒可以有效地促进细胞对Ce6的摄取。 采用MTT法考察CHT纳米粒对MCF-7细胞的光毒性和暗毒性。当CHT纳米粒中所含Ce6浓度在0.5-5μg/mL范围内时，若不给予光照处理，CHT纳米粒几乎没有毒性;若给予细胞660nm的NIR刺激，细胞存活率则随CHT纳米粒浓度的增大而减小。此外，对于光处理组，在相同的Ce6浓度下，CHT纳米粒的细胞毒性均显著大于Ce6溶液，说明CHT纳米粒可以提高Ce6的光动力疗效。用MTT法考察PTX/CHT纳米粒的化疗/光动力联合治疗效果:当MCF-7细胞用低浓度处方进行孵育时（Ce6浓度:0.000175-0.175μg/mL），NIR处理组和非NIR处理组的细胞存活率几乎没有差异，说明低浓度的Ce6不足以产生光动力治疗效果;当Ce6浓度增大到1.75μg/mL，PTX/CHT纳米粒加NIR照射组的细胞存活率显著低于PTX/CHT纳米粒不加NTR照射组(p=1.9×e-8＜0.01)，说明光动力治疗的加入可以有效增强PTX/CHT纳米粒的抗肿瘤活性。 用FITC-AnnexinⅤ/PI双染法测定细胞凋亡情况，结果表明相比于单一的光动力治疗（CHT纳米粒加NIR照射）和单一的化疗（PTX/CHT纳米粒，无NIR照射），PTX/CHT纳米粒可以通过光动力/化疗联合治疗的模式显著提高细胞凋亡率。 划痕实验结果表明，CHT和低分子肝素处理都可以显著抑制MCF-7细胞的迁移，且二者的相对划痕宽度没有显著性差异;表明CHT纳米粒与低分子肝素的抗肿瘤转移活性相当。 用小动物活体成像仪对注射了CHT纳米粒或Ce6溶液的荷瘤小鼠进行实时监控，记录不同时间点的在体成像照片。发现相比于Ce6溶液，CHT纳米粒可以促进Ce6在肿瘤部位的蓄积并延长其在肿瘤部位的滞留时间。 体内抑瘤实验结果表明:相对于单一的化疗或光动力治疗，联合治疗(PTX/CHT纳米粒加NIR刺激)可以有效地抑制肿瘤生长;联合治疗不会导致小鼠体重急剧下降，也不会对其主要脏器造成重大损伤，具有较好的安全性。 综上，本课题提出了一种简单有效的方式，成功地将肿瘤的化疗和光动力治疗，诊断与治疗整合到一个纳米体系中。该体系还具有良好的还原响应性:肿瘤细胞内部的还原条件可以触发化疗药物PTX的释放并且提高Ce6的NIR荧光强度以及活性氧(ROS)产量，从而增强化疗、光动力治疗效果以及荧光成像强度。
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