摘要
目的：河南省林州（原林县）及其毗邻的安阳，辉县等地是世界上食管癌发病率和死亡率最高的地区。食管癌仍然是该地区肿瘤相关死亡的主要原因，其原因主要是缺乏敏感的早期诊断指标和方法，缺乏有效的防治措施。过去研究资料提示，食管癌变是一个多阶段、多步骤的演进过程。食管癌的易感人群的早期特征是上皮细胞增生异常，食管上皮增生异常的形态学表现主要为基底细胞过度增生(Base cell hyperplasia，BCH)、间变(Dysplasia，DYS)和原位癌(Cancer in situ，CIS)，这些病变被认为是食管的癌前病变。癌前病变的显著特征之一是具有双向发展不稳定特性，即：这些病变可维持在某一阶段多年不变，或发展成更为严重的病变，亦可逆转到正常或较轻的病变。很显然，单纯从形态学角度，难以解释这种现象，本研究的思路正是在老一代科学家工作的基础上，通过对河南食管癌高低发区无症状居民进行内镜活检，寻找早期癌和各级癌前病变患者，建立一个食管癌不同发展阶段大样本资料库，在此基础上，进一步利用分子生物学技术研究这些不同病变组织的p53-Rb系统变化(包括p53，Rb，p15，p16，Waf1p21，Cyc4inD1，PCNA)，同时检测血清中相应的抗体，目的是阐明食管癌变机制，寻找建立用于高危人群检测和早期诊断的生物指标和手段，为食管癌防治提供重要的理论基础和手段，最终降低食管和贲门癌的发病率和死亡率。 方法：本研究研究对象来自河南食管癌高发区(n=2539)和低发区(n=262)无症状人群，所有研究对象均未作任何人为筛选。这些人群的详细资料，包括年龄，性别均作详细记录。所有研究对象均征得本人同意。本研究中，食管癌患者也来自同一地区。所有收集的手术切除标本术前患者均未作化疗或放疗，所有被检者均排除急性感染、过敏、自身免疫性疾病等影响血清蛋白质表达的疾病。 内镜和黏膜活检检查 每例受检者，均在食管中、下段（距门齿30-32cm和食管/贲门交界线上2-3cm处）各取一块活检组织，并在肉眼可见的病灶处随机取材。所有活检组织均迅速经85％酒精固定，石蜡包埋和5μm连续切片，切片用于HE染色，病理诊断，免疫组化等。 内镜结果诊断标准 慢性食管炎，反流性食管炎，Barrett's食管均根据洛杉矶标准进行诊断。 组织学诊断标准 食管组织诊断标准采用我们实验室以往建立的标准，根据组织结构和细胞特征，将食管上皮分为正常(Normal，NOR)，基底细胞过度增生(Base cell hyperplasia，BCH)、不典型增生(Dysplasia，DYS)和鳞状细胞癌(Squamous Cell Carcinoma，SCC)。 免疫组化 利用卵蛋白-生物素-辣根过氧化氢酶复合物法(Avidin-biotin complex，ABC)，检测食管癌各级病变组织中p53，Rb，p15，p16，Waf1p21，CyclinD1，PCNA抗原的变化。免疫蛋白阳性着色主要定位于细胞浆或细胞核，为棕黄色或棕褐色，高倍镜下(×40)选取5个视野，阳性细胞数=10％为阳性。 血清抗体ELISA分析 血样采集与保存对288例研究对象每例均取空腹静脉血5ml至离心管中，室温下静置30分钟，而后2000转/分离心20分钟，吸取血清每管100μl分装，液氮保存，普查结束后转至-80℃冰箱内储存备用。 血清自身抗体检测用美国Scripps研究所自行提取和纯化的p53，p16抗原对以上血清标本进行检测。采用本实验室已建立的间接酶联免疫吸附试验方法，各包被抗原的稀释终浓度为0.5μg/μl，血样稀释浓度为1∶50，辣根过氧化物酶标记的抗人IgG稀释浓度为1∶5000。在Elisa板孔中加入用包被稀释液稀释过的抗原100μl/孔，4℃，过夜（24h以上）。加入稀释后的病人血清100μl/孔，每个样品至少做两次检查，37℃孵育。已知阳性的血清为阳性对照，包被缓冲液为阴性对照。加入稀释的辣根过氧化物酶标记的抗人IgG100μl/孔，37℃孵育。加入TMB-过氧化氢尿素显色液，100μl/孔，置37℃避光反应，当阳性对照出现明显颜色变化后，每孔加入终止液50μl终止反应，并在ELISA Reader读取OD450光密度值。 血清抗体检测结果判定采用Scripps研究所判定方法，即正常血清OPD读数均数±3标准差，即Cut-off值（截断值），读数在此值以上的为阳性，否则为阴性。 统计学分析 采用SPSS10.0统计软件处理，免疫组化各组间蛋白表达情况的比较采用x2检验。ELISA配对资料比较采用x2检验和Spearmans相关性分析，食管癌高、低发区各级癌前病变的分布采用成组设计两样本比较的秩和检验。显著性水准均取a=0.05。 结果：1、食管癌高、低发区居民内镜普查，组织学检查 食管癌各级癌前病变在高低发区检出率分布不一致，且高发区DYS检出率高于低发区(P＜0.01)。高发区10例SCC中，均发生在男性。30～50岁年龄段男性DYS检出率高于女性(P＜0.01)。低发区3例DYS均发生在男性，30～50岁年龄段男性BCH检出率高于女性(P＜0.05)。人群食管内镜诊断和粘膜活检组织病理诊断结果的一致性较低，尤其是对癌前病变。 2、食管癌高发区居民p53，Rb，p15，p16，Waf1p21，CyclinD1，PCNA变化 高发区居民p53，Rb，p15，p16，Waf1p21，CyclinD1，PCNA在各级癌前病变组织中阳性表达率不同，随着病变加重，p53阳性表达率呈上升趋势，统计学上差异显著(P＜0.01)，p15，p16，Waf1p21阳性表达率呈下降趋势，统计学上差异显著(P＜0.05)。 3、食管癌高发区居民血清p53，p16抗体检测 在食管各级病变患者血清中，p53，p16抗体反应阳性百分率从正常到各级病变均有升高趋势，且p53在食管各级病变患者血清中阳性反应具有线性趋势(P＜0.01)，在正常和病变较重的DYS和SCC之间有显著性差异(P＜0.01)。 结论：1.内镜活检是发现高发区人群早期食管癌，特别是各级癌前病变的重要有效手段。 2.食管癌高发区各级癌前病变的检出率与20年前相比没有明显降低。 3.食管内镜诊断和粘膜活检组织病理诊断结果的一致性较低，食管轻度病变在纤维内镜下不能识别是导致纤维内镜和病理诊断结果不一致的重要原因。 4.p53-Rb系统是食管癌变早期发生频率最高的一组分子事件，是导致食管癌变及阶段演进的重要分子机制。 5.检测血清抗体可能是食管癌早期发现和高危人群预警的有效途径。 6.与西方国家不同，Barrett's食管与河南食管癌高发区食管癌变的关系并不密切。
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