摘要
目的： 胃肠道间质瘤(Gastrointestinal stromal tumor，GISTs)是一类胃肠道最常见的间叶源性肿瘤，具有不确定的恶性潜能。应用先进的分子生物学技术研究相关基因的变化与蛋白表达是当前人类恶性肿瘤研究的重要领域，对揭示肿瘤进展机制，指导治疗，预测预后有着非常重要的意义。本研究根据GISTs基因缺失、扩增的改变，筛选p16、nm23等指标，并检测相关抑癌基因超甲基化情况，旨在选择有价值的分子生物学指标以完善预后评价系统，为GISTs的诊治与预后预测提供重要的参考依据。 方法： 1.收集山西医科大学第一医院1994-2004年间胃肠道间叶肿瘤标本98例，HE，免疫组化CD117、CD34、SMA、S-100染色。 2.在87例GISTs及文献报道有CD117表达的其他肿瘤中用免疫组化的方法检测PKC-θ的表达。 3.比较基因组杂交(comparative genomic hybridization，CGH)技术检测2005-2006年20例新鲜GISTs标本的细胞遗传学改变。 4.免疫组化方法检测62例GISTs中p16、PTEN、p53、Cmyc、MDM2、nm23、E2F1、Ki-67的表达。 5.对2003-2006年56例CD117阳性的GISTs，采用甲基化特异性PCR(MSP)方法研究石蜡包埋组织中E-cadherin和p16基因启动子区超甲基化状态;免疫组化法检测二者蛋白的表达。 结果： 1.87例GISTs中62例有随访资料。PD（progressive disease-死于该肿瘤或该肿瘤发生肝脏、腹膜等邻近器官转移称为进行性疾病）发生率随侵袭危险性级别升高而升高，统计学分析发现Ⅳ级PD的发生率明显高于Ⅲ级（P＜0.005）和Ⅰ级、Ⅱ级(P＜0.005);CD117阳性表达71例(81.6％)，CD34阳性表达62例(71.3％)。CD117阳性表达与Fletcher CD分级无关（P＞0.1）。 2.87例GISTs中77例(88.5％)PKC-θ阳性表达，71例(81.6％)CD117阳性表达，4例(4.6％)两者均为阴性。16例CD117阴性的GISTs中PKC-θ阳性表达12例。PKC-θ表达与CD117表达无相关性（P＞0.05），但与Fletcher分级和PD呈正相关关系（P＜0.01）。CD117阳性表达的其他肿瘤中PKC-θ呈阴性表达，而PKC-θ阳性仅见于GISTs神经鞘瘤和恶性神经鞘瘤。 3.20例GISTs细胞染色体均有不同程度的变化，包括染色体全部或部分的扩增或缺失，平均每个病例有6.0处染色体DNA拷贝数的改变。丢失多于扩增，分别为3.55和2.45。常见的缺失包括14q(70％)，1p(50％)等;常见的扩增区域主要见于17q(40％)，5p(35％)等。 4.(1)62例GISTs中，p16在不同侵袭危险性GISTs中表达有差异（P＜0.001），随着GISTs侵袭危险性的升高，p16表达强度降低。p16阳性细胞数小于50％的病例其PD病例数高于阳性细胞数50％-75％和阳性细胞数大于75％的病例，统计学分析，p16蛋白表达强度之间PD有差别(P＜0.001)。 (2)PTEN阴性表达率19.4％，且其表达随着肿瘤分级的增高，阴性例数增多。相关性分析表明，PTEN表达与危险度分级呈显著相关性(P＜0.01)，但表达强度各组之间PD差异无显著性(P＞0.05）。 (3)62例GISTs中有26例p53蛋白阳性表达，随肿瘤分级增高，阳性表达例数逐渐增多，肿瘤恶性度增高，p53表达增强，呈显著正相关(P＜0.01)。p53(++)的病例其PD发生率高于(-)病例（P＜0.05）。 (4)Cmyc在GISTs中的阳性表达率为80.6％，肿瘤恶性度增高，Cmyc表达例数增多，Cmyc表达与肿瘤分级有关（P＜0.001）。Cmyc(+++)的病例与(+)和（-）的病例中PD发生率有差异(P＜0.01);(++)的病例与(+)和(-)病例中PD发生率有差异(P＜0.05)。 (5)MDM2在各级间的阳性率分别为0.0％，0.0％，15.8％，61.1％，高度危险组表达率明显高于其余三组，MDM2表达与肿瘤恶性度有关(P＜0.05）。MDM2阳性细胞数(++)的病例PD发生率高于阳性细胞数(+)和（-）病例(P＜0.05)。 (6)62例GISTs中，nm23均有不同程度的阳性表达，与肿瘤分级呈负相关性(P＜0.01)。nm23阳性细胞数(+)的病例PD发生率明显高于其余两组(P＜0.01)。 (7)E2F1蛋白在GISTs中的阳性率为71.0％，危险度分级与E2F1表达强度之间有显著相关性(P＜0.05)。E2F1(+++)的病例中PD发生率与其它组间有差异(P均＜0.01)。 (8)Ki-67在Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ级GISTs病例中的增殖指数分别为0.0％、16.7％、36.8％、94.4％，Ki-67阳性细胞数与肿瘤恶性度有关，相关性分析，二者有显著性意义(P＜0.05)。 5.56例GISTs中E-cadherin(CDH1)基因超甲基化率为32％(18/56)，p16基因启动子区甲基化率34％(19/56)。统计分析表明56例病例中E-cadherin(CDH1)和/或p16基因启动子区甲基化状态与该肿瘤生物学行为(23/56，41％)及部位有相关性(P＜0.05)。但与患者年龄、性别以及组织学类型间的差异无显著性（P＞0.05）。 6.p16基因启动子区甲基化率为34％(19/56)，免疫组化分析结果显示，p16蛋白表达阳性部位为细胞核，低表达率为44.6％，蛋白表达强度与肿瘤分级之间的差异具有显著性(P＜0.05)，p16基因CpG岛甲基化与蛋白失活相关，是GISTs发展的重要事件。p16表达强度与组织学类型、部位、年龄、性别差异无显著性(P＞0.05)。 结论： 1.肿瘤大小和核分裂是评价GISTs生物学行为的重要指标，CD117阳性是GISTs诊断及格列卫治疗的依据，但无预后意义。 2.PKC-θ可能是比CD117还要敏感且特异的GISTs标记物，尤其对于PDGFRα基因突变的上皮样细胞型和CD117阴性的病例，可以作为GISTs诊断和格列卫治疗的补充指标。 3.GISTs染色体存在着非随机的DNA拷贝数扩增或缺失的位点，提示这些位点可能含有候选的原癌基因和抑癌基因。14q和22q的缺失是GISTs发生的早期事件，具有1p缺失的GISTs患者可能预后较差，9p的缺失和17q、20q扩增可能是GISTs恶性进展的标志，8q扩增和13q的缺失的预后意义有待考证。 4.p16阳性细胞数大于50％，Ki-67增殖指数可能是GISTs有价值的预后参考指标;nm23、Cmyc可以作为预测GISTs侵袭行为的指标;E2F1可能是GISTs的一个不良预后因子，但还需结合其他的分子生物学指标及更多样本例数来综合评估;MDM2敏感性较差，不适合作为GISTs预后的常规标记物;PTEN、p53能否作为GISTs的预后标记物，还有待考证。 5.联合检测E-cadherin和/或p16启动子区超甲基化可能成为GISTs危险度评估的有效手段，并将对该病的治疗提供新的思路。p16蛋白启动子区超甲基化可能是p16蛋白表达下调的原因之一。 本研究的创新点： 1.本研究涵盖胃肠道间质瘤(GISTs)的病理诊断、预后因素和治疗三个不同领域，涉及相关基因改变、蛋白表达，这样的系统研究尚无前例。 2.根据GISTs特异的基因改变，结合国内外研究现状，针对性的选取分子生物学指标，对其表达情况及与GISTs预后的关系进行探讨，完善预后评价标准。 3.率先对不同部位GISTs中E-cadherin(CDH1)、p16基因启动子区甲基化状态进行研究，探讨联合检测的意义，对GISTs治疗提供新的思路。
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