摘要
目的：慢性疼痛已经成为重大的公共卫生问题，未能缓解的疼痛会给病人带来巨大的生理和心理障碍，有效的疼痛治疗已经成为现代医疗的重要组成部分。然而，慢性疼痛机制十分复杂，至今尚未完全阐明，因此目前仍缺乏有效的治疗措施。 目前已经知道，脊髓背角NMDA受体的激活，启动相关信号途径的级联反应，最终导致了中枢神经多种机能改变和神经可塑性变化的产生，这一机制在疼痛的发生中有关键性作用。钙网蛋白具有多种重要生理功能，在神经系统的生理、病理过程中发挥重要作用。研究发现，神经系统钙网蛋白与病理状态下的神经元修复、重塑过程密切相关;对多种伤害性刺激引起的神经损伤有保护作用;另外，还与某些疼痛治疗药物的作用机制有关。这些均提示钙网蛋白可能与疼痛机制有一定的联系，但国内外尚无深入研究。 本研究的目的在于探讨钙网蛋白与疼痛的关系，并对其在疼痛中的作用及可能机制进行研究，以期为疼痛治疗探索一个新的可能靶点。 方法:1.钙网蛋白在疼痛大鼠脊髓中的表达 1.1、首先观察脊髓钙网蛋白在不同疼痛模型中的表达： 方法：SD大鼠30只，随机分5组，分别制作福尔马林炎性痛模型及盐水对照，保留性坐骨神经分支损伤(SNI)模型、慢性缩窄性坐骨神经损伤(CCI)模型及假手术对照。观察大鼠疼痛行为学改变，应用免疫组化技术观察各组大鼠脊髓背角c-Fos的表达，并应用western blot技术检测各组大鼠脊髓钙网蛋白的表达。 结果：与对照组相比，各模型组大鼠脊髓后角c-Fos阳性神经元增多（P＜0.05）;SNI模型组和CCI模型组大鼠脊髓钙网蛋白的表达均上调（P＜0.05），福尔马林炎性模型组大鼠脊髓钙网蛋白变化无统计学意义(P＞0.05)。 1.2、然后研究脊髓钙网蛋白在SNI模型中的表达特点： 方法：制作大鼠SNI模型，观察大鼠疼痛行为学改变，检测术侧后爪50％缩爪阈值。在不同时点处死大鼠，取脊髓，应用western blot技术观察大鼠脊髓钙网蛋白的表达在大鼠疼痛发展过程中的动态变化，并应用免疫荧光染色技术观察钙网蛋白在脊髓中的定位。 结果：SNI损伤导致大鼠患侧后爪50％机械缩爪阈值进行性降低（P＜0.05），同时导致大鼠脊髓背角钙网蛋白的表达上调（P＜0.05），主要表达在神经元而不是胶质细胞中;western blot检测不同时点脊髓钙网蛋白的表达见其上调变化趋势与疼痛行为学表现的严重程度相一致。 2.脊髓钙网蛋白对大鼠疼痛的影响 2.1、观察钙网蛋白反义寡核苷酸鞘内注射抑制脊髓钙网蛋白表达对正常大鼠疼痛的影响： 方法：4组大鼠均经枕骨大孔行鞘内置管，分别给予鞘内注射盐水，钙网蛋白正义寡核苷酸(SODN)20μg，反义寡核苷酸10μg和20μg，每日一次，连续7天，观察大鼠痛觉行为学变化，并用RT-PCR和Western blot技术检测脊髓钙网蛋白的表达。 结果：钙网蛋白ASODN鞘内注射明显下调大鼠脊髓钙网蛋白的表达（P＜0.05），钙网蛋白SODN对大鼠脊髓钙网蛋白表达无明显影响(P＞0.05)，二者均对大鼠50％机械缩爪阈值无明显变化（P＞0.05）。。 2.2、观察钙网蛋白反义寡核苷酸鞘内注射抑制脊髓钙网蛋白表达对SNI模型大鼠慢性疼痛的影响： 方法：SD大鼠24只，随机分成4组，经枕骨大孔行鞘内置管，其中一组留作对照，接受假手术，其余制作SNI模型。假手术对照和SN工模型对照组每日给予鞘内注射生理盐水，其余两组分别给予钙网蛋白ASODN20μg和正义寡核苷酸(SODN)20μg，连续7天。观察大鼠痛觉行为学和脊髓钙网蛋白表达的变化。 结果：SNI大鼠脊髓钙网蛋白明显上调（P＜0.05），钙网蛋白ASODN鞘内注射抑制SNI大鼠脊髓钙网蛋白的上调（P＜0.05），并对大鼠慢性疼痛有明显缓解作用，连续给药7天后50％机械缩爪阈值较未处理SNI疼痛大鼠明显增高（P＜0.05）。 3.钙网蛋白在谷氨酸伤害性刺激中的作用和机制 3.1、探讨慢性谷氨酸刺激对PC12细胞钙网蛋白和MAP2表达的影响及其机制： 方法：NGF诱导分化的PC12细胞经25μM的谷氨酸处理24h，分别用MTT法检测细胞活力，用流式细胞术检测细胞凋亡，用RT-PCR和Western blot技术检测钙网蛋白的表达，用western blot检测p38MAPK的磷酸化及和MAP2的表达，用免疫荧光染色观察MAP2表达的特点;并观察1mM SB203580处理对上述变化的影响。 结果：25μM谷氨酸处理24h引起PC12细胞凋亡率的轻微增高（P＜0.05），显著上调p38丝裂原激活蛋白激酶(MAPK)的磷酸化及钙网蛋白和微管相关蛋白(MAP)2的表达（P＜0.05），但对细胞活力无明显影响(P＞0.05);1mM SB203580可抑制p38MAPK的磷酸化（P＜0.05），对谷氨酸处理所致细胞凋亡、钙网蛋白和MAP2的表达上调均有抑制作用。 3.2、观察反义寡核苷酸抑制神经元样PC12细胞钙网蛋白表达对慢性谷氨酸刺激所致凋亡及MAP2表达的影响，探讨钙网蛋白在其中的作用： 方法：用脂质体介导的反义和正义寡核苷酸转染NGF诱导分化的PC12细胞，以25μM的谷氨酸处理24h后，用流式细胞术检测细胞凋亡，用western blot和RT-PCR检测钙网蛋白的表达，并用免疫荧光技术观察MAP2的表达变化。 结果：脂质体介导的反义寡核苷酸转染特异性抑制25μM的谷氨酸处理24h引起的PC12细胞钙网蛋白表达（P＜0.05），显著增高细胞凋亡率（P＜0.05），并抑制MAP2的表达（P＜0.05）。 结论：脊髓钙网蛋白上调促进慢性神经病理性疼痛的发生和发展，在慢性神经病理性疼痛机制中发挥作用，其机制与伤害性刺激引起的p38MAPK途径激活及神经可塑性变化有关。在持续的伤害性刺激作用下，p38MAPK磷酸化增多，导致钙网蛋白表达上调;一方面发挥神经保护作用，另一方面对MAP2的表达产生影响，促进神经突的生长，导致神经可塑性变化。
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