摘要
脑缺血再灌注损伤的病理生理机制非常复杂，尚未完全明确。近来证据表明，炎症免疫反应是脑缺血再灌注损伤机制之一。炎性瀑布反应触发后加剧脑损伤的发展，其中炎性受体发挥了重要作用。Toll样受体((Toll-Like receptors，TLRs)是一个介导天然免疫的古老家族，是历数亿年演化而仍然保存的宿主防御机制之一。1998年Poltorak等发现了TLR4以来，其作为炎症跨膜受体在感染性疾病研究领域中已是热点。现哺乳动物中共发现了13种Toll样受体，其中TLR4是启动炎症反应的“门户”蛋白，是目前哺乳动物唯一将细胞外抗原信息向细胞内传递的并引发固有免疫炎症反应的源头跨膜蛋白，是机体炎症反应链的起始点和调控点。TLR4广泛分布于单核巨噬细胞系统、内皮细胞、树突细胞等免疫细胞，其激活将引起一系列下游分子的活化，并活化核因子kappa B（nuclear factor，NF-κB）、AP蛋白(acute phase protein，AP)等，最终引起以TNF-α、IL-1等为中心的促炎症因子激活，放大炎症效应，导致多种炎症因子的瀑链式释放。近年来，随着研究的深入，发现TLR4与心、肝缺血性病理损伤关系密切。但TLR4是否也参与了脑缺血炎性损伤，尚缺乏相关基础研究报道。本课题采用线栓法制造局灶性脑缺血再灌注损伤大鼠模型来探讨TLR4的激活与脑组织缺血再灌注损伤的关系，并以此为基础通过构建针对TLR4基因的短发夹结构真核表达载体，研究此RNAi干扰机制对小鼠小胶质细胞（BV-2细胞）对缺血再灌注诱导炎症反应的抑制作用，探索通过对TLR4的阻断效应来有效调控脑缺血炎症损伤的可能性，为治疗脑缺血损伤提供新思路。 第一部分 TLR4在大鼠脑缺血再灌注损伤中的表达及其意义 目的：探讨脑组织缺血再灌注损伤中TLR4的表达及其意义 方法：采用线栓法制造局灶性脑缺血再灌注损伤大鼠模型，模型分为假手术组和缺血再灌注组（I/R组）。其中I/R组又根据不同再灌注时间分为缺血再灌注1小时(I/R1h)，3小时（I/R3h），6小时(I/R6h)，12小时(I/R12h)，24小时(I/R24h)5个亚组。局灶性脑缺血2小时后再灌注，按分组规定的时间点断头取脑。采用免疫组织化学法观察不同再灌注时间点缺血侧脑组织TLR4和NF-κB分布并测定阳性反应的平均光密度值，同时应用酶联免疫方法检测TNF-α和IL-1β在不同再灌注时间点缺血脑组织内浓度。 结果：（一）大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤过程中，再灌注各时间点均观察到TLR4蛋白有增强表达，且再灌注早期(即1h)有最强表达，主要分布在皮质缺血半影区、纹状体区，表达细胞主要是小胶质细胞，与假手术组比较有显著差异(P＜0.01)。（二）在各灌注时间点均有NF-kB阳性细胞表达，6小时阳性表达已开始明显增强，24小时达高峰，在缺血再灌注各组缺血侧皮质区及纹状体区NF-kB阳性细胞明显多于假手术组(P＜0.01)。（三）与假手术组相比，再灌注后3小时缺血侧半球皮质内TNF-α含量明显升高（4.84±0.25 ng/ml vs1.69±0.44ng/ml,P＜0.01）;再灌注后12小时缺血侧半球皮质内TNF-α含量达到高峰(11.26±2.02 ng/ml vs1.69±0.44ng/ml,P＜0.001);再灌注后24小时缺血侧半球皮质内TNF-α含量逐渐下降。（四）与假手术组相比，再灌注后3小时IL-1β含量明显升高(4.47±2.13 ng/ml vs2.07±1.21ng/ml，P＜0.01);再灌注后12小时IL-1β含量达到高峰（14.39±2.58ng/ml vs2.07±1.21ng/ml P＜0.001）;再灌注后24小时IL-1β含量逐渐下降。 结论：脑组织缺血再灌注过程中TLR4蛋白的激活表达有可能是作为重要炎性受体介导脑缺血炎性损伤 第二部分 TLR4基因的短发夹结构真核表达载体的构建及鉴定 目的：构建针对TLR4mRNA的小发夹结构RNA(shRNA)真核表达载体pEGFP-siRNA/TLR4。 方法：以携带有增强型绿色荧光蛋白基因(enhanced green fluorescence gene，EGFP)及shRNA克隆位点的质粒的pEGFP-H1为基础，运用网络工具设计针对TLR4mRNA的寡核苷酸片段，经过退火、BbsⅠ酶切载体pEGFP-H1、用胶回收试剂盒回收目的DNA、连接反应等步骤将其克隆入pEGFP-H1，构建表达EGFP及TLR4-shRNA的真核表达质粒pEGFP-H1/TLR4，然后将其转入大肠杆菌E.coli.DH5a进行扩增筛选，改良碱裂解法小量提取质粒，最后经MluⅠ单酶切鉴定并送上海生工公司测序。 结果：重组携带针对TLR4 mRNA的shRNA质粒pEGFP-H1/TLR4-siRNA及其对照序列的质粒pEGFP-H1/control-siRNA均经过MluⅠ单酶切后，1.5％琼脂糖凝胶电泳分析酶切反应结果出现5.0kb和220bp的条带，与实验设计的质粒长度一致，且测序证实克隆序列正确。 结论：成功的构建了针对TLR4 mRNA的shRNA真核表达载体pEGFP-siRNA/TLR4。 第三部分 RNA干扰对BV-2细胞缺血再灌注诱导炎症反应的调控 目的：研究针对TLR4基因的RNA干扰技术对BV-2细胞在缺血再灌注条件下诱导分泌肿瘤坏死因子TNF-α的抑制作用，探索通过对TLR4的阻断效应来有效调控脑缺血炎症损伤的可能性。 方法：培养BV-2细胞随机分为C组（正常培养组）和IR组（缺血再灌注组）两大组，其中IR组又分为N组（非转染组）、T组(TLR4-siRNA转染组，加入含pEGFP-H1/TLR4的质粒)，TC组（对照RNAi组，加入含对照序列pEGFP-H1/control的质粒）及TB组（空白对照组，加入pEGFP-H1质粒）四个亚组。运用脂质体转染技术将pEGFP-H1/TLR4-siRNA转染至培养的小鼠小胶质细胞系BV-2细胞，观察细胞系中荧光表达强度，流式细胞仪检测质粒转染效率，并用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测各组BV-2细胞TLR4和NF-κBmRNA的表达，Westernblot方法检测各组BV-2细胞TLR4蛋白表达，ELISA方法检测各组BV-2细胞在缺血再灌注前后TNF-α含量变化，流式细胞仪检测各组细胞凋亡和坏死情况。 结果：（一）将pEGFP-H1/TLR4-siRNA转染至BV-2细胞后，EGFP的表达率为(67.58±7.16)％;（二）TLR4 mRNA在正常培养BV-2细胞中有一定程度表达，在缺血再灌注各组BV-2细胞中TLR4 mRNA水平均较C组明显高表达， NF-kB也显著性上调(P＜0.01);经过RNAi干扰后，T组BV-2细胞中TLR4和NF-kB mRNA表达得到部分的抑制，较N组明显减少，两者相比差异有统计学意义(P＜0.01）。但TC组和TB组BV-2细胞中TLR4和NF-kB mRNA与N组相比差异无明显统计学意义(P＞0.05)。（三）在缺血再灌注各组BV-2细胞中TLR4蛋白水平均较C组明显高表达，经过RNAi干扰后，T组BV-2细胞中TLR4蛋白表达得到部分的抑制，较N组明显减少，两者相比差异有统计学意义(P＜0.01)。但TC组和TB组BV-2细胞中TLR4蛋白表达与N组相比差异无明显统计学意义(P＞0.05)。（四）缺血再灌注各组上清液中TNF-a含量均较C组明显升高（P＜0.01）;而在缺血再灌注各组中，TC组上清液中TNF-α含量与N组相比无明显统计学意义(1.61±0.31 ng/ml vs1.72±0.42ng/ml,P＞0.05)， TB组上清液中TNF-α含量与N组相比差异也无明显统计学意义(1.69±0.33 ng/ml vs1.72±0.42 ng/ml,P＞0.05);T组上清液中TNF-α含量则较N组明显减少(0.96±0.35 ng/ml vs1.72±0.42 ng/ml，P＜0.01)。（五）T组其早期凋亡细胞百分数及晚期凋亡和继发坏死细胞百分数均明显低于N组、TC组和TB组，而活细胞百分数明显高于N组、TC组和TB组，经检验差异具有显著性意义(P＜0.01)。 结论：针对TLR4 mRNA的RNA干扰技术能够有效抑制BV-2细胞经缺血再灌注诱导的TLR4上调，导致下游的转录因子NF-kB表达的下调，从而引起BV-2细胞分泌TNF-a含量的减少，表明针对TLR4 mRNA的RNAi技术可以有效的抑制缺血再灌注诱导的BV-2细胞的炎症反应。
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