摘要
根据最新流行病学调查，目前全球约有2.5亿人感染乙型肝炎病毒(HepatitisB virus，HBV)，HBV感染仍然是一个严重的全球公共卫生问题，其中部分慢性HBV感染者可进展为慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B，CHB)、肝硬化、肝衰竭和肝细胞癌(hepatocellar carcinoma，HCC)，每年大约有超过100万人死于HBV感染相关疾病。HBV的高效复制及其逆转录过程缺乏校正机制导致HBV在感染患者体内以准种(quasispecies，QS)的形式存在，即某一感染患者体内的HBV病毒种群虽然在遗传学上高度相关，但病毒株间的基因组序列却存在差异，这一种病毒形式的存在定义为QS。HBV准种的特征和动态变化模式与疾病临床表现、抗病毒治疗应答和疫苗效果密切相关。了解HBV全长基因组准种的特征有助于患者抗病毒治疗的个性化管理。目前对于HBV准种的测序方法主要依赖聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)产物直接测序、PCR-克隆-测序(clone-based sequencing，CBS)以及二代测序(next generation sequencing，NGS)技术，其中直接PCR测序只能检测到整个HBV准种群中丰度为20％的突变，CBS被认为是“金标准”，但是这种方法费时费力，突变检测敏感性取决于克隆数量，对于全长准种通常敏感性不高。二代测序在研究准种方面较前两种方法有明显的优势，但也有其不足，例如读长的限制，通常为100～300个碱基对(base pair，bp)，且需要结合分子克隆的结果进行判读。随着基因测序技术的快速发展，多种第三代测序(the third-generation sequencing，TGS)技术出现，实现高通量测序的同时读长显著增加，其中以单分子实时测序(Single Molecule RealTime(SMRT)DNA sequencing technology）为突出代表，为HBV准种研究提供了潜在的新研究方法。 研究目的： 目前尚无三代测序应用于HBV全长准种的相关检测研究，本研究针对HBV全长基因组准种，通过比较PCR-克隆测序和三代测序，初步探讨现有技术条件前提下，更适合于研究HBV全长基因组准种构成和特性的方法。 研究方法： 本研究共纳入13例样本，分为质控组和实验组。质控组3个，命名为C01、C02、C03，由包含确定的不同比例的基因B型和C型HBV全基因克隆质粒组成，实验组10例为2015年2月至2015年12月间就诊于山东大学第二医院符合《慢性乙型肝炎防治指南》的CHB患者。所有入组样本均进行HBV DNA抽提，PCR扩增，应用CBS及TGS方法测序，并用两种方法所得测序结果分别分析HBV准种的复杂度、离散度和HBV突变检测等指标，以探讨TGS在分析HBV准种异质性方面的效能和特点。 研究结果： 两种方法获得的准种克隆数量比较。平均每个样本由CBS方法获得的准种克隆数为21.77±3.63个，而TGS方法获得的准种克隆数为560.31±233.42个，TGS方法获得的准种数远大于CBS方法(P＜0.01)。 质控组的结果表明两种方法检测到的准种异质性的比例均与预期标准值相符，且TGS方法检测准种异质性的比例比由CBS方法检测得到的与预期标准值更加接近。质控组从TGS方法获得的准种复杂度与从CBS方法获得的准种复杂度具有较好的一致性，均与准种复杂度的理论值相符。 试验组在分析准种复杂度方面，利用配对t检验（或者Mann-Whitney检验），除了核苷酸水平的PreS2区（P=0.021）和氨基酸水平的PreS1区(P=0.025)、PreS2区（P=0.019）外，HBV全长基因组及其他分区两种方法得到的准种复杂度值没有差异(P＞0.05)。在相关性分析中，除了HBV全基因组外，各个分区的准种复杂度值均呈正相关。在Bland-Altman一致性分析中，结果显示除了HBV全基因组（P=0.13）外，HBV其他各个分区CBS和TGS有较高的一致性。在分析准种离散度方面，利用配对t检验（或者Mann-Whitney检验），除了核苷酸水平BCP区、X区（P值分别为0.044和0.021）的遗传距离，S区的dS（P=0.030）外，HBV全长基因组及其他分区的准种复杂度值没有差异（P＞0.05）。在相关性分析中，HBV全基因组及各个分区的准种复杂度值均呈正相关。在Bland-Altman一致性分析中，HBV全基因组及HBV其他各个分区CBS和TGS有较高的一致性。 与基因B型标准序列D00330和基因C型标准序列AB033556进行比对，CBS共检测出1101个变异，平均每位患者检测到110.1±26.98个变异，TGS共检测出3059个变异，平均每位患者检测到305.9±162.45个变异。针对RT区，S区，C区，X区，PreC区，BCP区文献中已有报道的常见单核苷酸突变位点，两种方法共同检出50个阳性突变，阳性率为15.15％。CBS方法没有能够单独地检测出阳性突变，其阳性率为0％。TGS单独检出40个阳性突变，阳性率为12.12％，明显高于CBS(x2=157.14，P＜0.01)，表明TGS在突变检测方面明显敏感于CBS。在进一步的Kappa一致性检验中，Kappa值为0.645，表明两种方法在突变检测方面的一致性为高度。对于联合突变，A1762T/G1764A(5/10)和M204[Ⅰ/Ⅴ]/A181T(4/10)仅由TGS检测出。 由CBS和TGS方法获得的HBV全长病毒序列构建的进化树显示两株进化树的拓扑结构相似，并且由TGS方法获得的序列构建的拓扑结构比CBS方法获得的序列构建的拓扑结构更加复杂。 研究结论： 三代测序技术TGS在检测HBV全长准种异质性特征方面与“金标准”CBS具有良好的一致性。并且在准种克隆数量和突变检测的数量、敏感度方面均明显优于CBS。本研究初步认为TGS适合于研究HBV全长基因组准种构成和特性，并有高通量、高灵敏度及低成本的优势。以三代测序技术为基础的临床相关HBV全长准种特征值得进一步研究。随着基因测序技术提高和实验方法进一步地完善，检测患者HBV全长准种特征将更加方便快捷并有望标准化，使临床上针对不同准种特征的HBV感染者开展个体化诊疗成为可能。
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