摘要
本文主要从以下几部分进行研究： 1.Rho GTP酶在日本囊对虾先天免疫中的功能研究 经典的免疫理论将宿主的免疫应答分为先天性免疫应答与适应性免疫应答，脊椎动物可以通过两种免疫应答协同作用高效抵御病原微生物的感染，而无脊椎动物没有特异的适应性免疫，因此先天性免疫应答成为了无脊椎动物抵御病原微生物入侵的关键屏障。无脊椎动物先天免疫系统中存在复杂的信号通路网络来调控免疫应答，在这一网络中多种关键分子与效应分子发挥着至关重要的功能。作为调控多种信号途径和生理功能的分子开关，Ras GTP酶超家族的上百种成员在免疫应答中同样发挥着重要的作用，而Rho GTP酶家族成员在先天免疫中的功能研究相对甚少。我们以日本囊对虾Marsupenaeus japonicus为研究对象，发现了Rho GTP酶家族成员Cdc42与RhoA在对虾中通过不同的分子机制分别调控抗病毒免疫与抗菌免疫。 1)Cdc42通过与精氨酸激酶相互作用抑制对虾体内WSSV复制 小GTP酶广泛存在于真核细胞中，具有多个种类且发挥多种功能。作为Rho GTP酶的一个重要成员，Cdc42同样发挥多种功能，包括参与调节细胞生长、细胞迁移以及细胞运动等，然而也有一些RNA病毒通过劫持宿主细胞的Cdc42帮助自身感染宿主细胞。在高等生物中已经报道Cdc42发挥多种功能，但是在无脊椎动物的抗病毒免疫中Cdc42发挥的功能及其机制还不清楚。在本研究中，我们在日本囊对虾M.japonicus鉴定出一种Cdc42蛋白并命名为MjCdc42。在日本囊对虾受到白斑综合征病毒WSSV感染时，MjCdc42发生显著上调表达。通过RNA干扰和注射Cdc42抑制剂实验抑制MjCdc42表达水平可以增强WSSV复制，因此证明MjCdc42具有抑制病毒复制的功能。进一步实验确定MjCdc42与精氨酸激酶（命名为MjAK）相互作用。通过检测MjAK的结合活性、激酶活性以及通过RNA干扰、构建MjAK的突变体△MjAK，我们发现在对虾体内MjAK增强病毒复制;而精氨酸激酶活性抑制剂槲皮素(QU)可以削弱MjAK在病毒复制中发挥的功能。MjAK与WSSV囊膜蛋白VP26相互作用。进一步实验证明MjCdc42与MjAK的相互作用依赖于MjAK的活性位点Cys271，并且这一相互作用可以抑制MjAK促进病毒复制的能力。通过结合MjAK的活性位点Cys271和抑制其激酶活性，MjCdc42抑制对虾体内WSSV复制。综上所述，除了已经报道的调控细胞骨架与细胞吞噬等功能外，我们的研究阐明了Cdc42参与免疫反应的一种新功能，即通过与精氨酸激酶相互作用抑制宿主体内病毒的复制和扩增。 2)RhoA通过β-integrin介导的细胞吞噬在对虾中抑制细菌感染 近年来，已经报道超过一百种小GTP酶在一系列细胞进程中发挥关键的调控功能，比如细胞骨架重组、基因表达和信号转导调控。在无脊椎动物中，多种小GTP酶相继被报道参与先天免疫的调控。但Rho GTP酶家族的小G蛋白是否在先天免疫的调控中发挥功能还没有太多报道。目前已有文献确定Rac1和Cdc42可以帮助宿主细胞抵御入侵的病原感染，但是另外一种家族成员RhoA是否同样参与先天免疫调控以及调控机理如何还不清楚。我们在对虾体内成功克隆得到RhoA的cDNA全长序列并命名为MjRhoA，组织分布检测显示MjRhoA在血细胞与心脏中检测到。表达模式分析显示当对虾受到弧菌感染时，MjRhoA在血细胞与心脏中的表达水平发生显著上调。利用RNA干扰技术敲低MjRhoA的表达水平后，对虾清除细菌的能力与对虾的存活率均明显降低。这些结果证实MjRhoA在体内具有抵抗细菌感染的能力。有趣的是，我们发现在受到弧菌感染时MjRhoA从细胞质中向细胞膜移动;而β-intergrin介导的细胞吞噬关键基因ROCK2和Arp2/3的表达水平受到MjRhoA的调控。进一步研究显示，敲低β-intergrin的表达水平直接影响MjRhoA在体内的表达与亚细胞定位变化。因此，MjRhoA应该通过促进β-intergrin介导的细胞吞噬抑制对虾体内细菌感染。我们的研究确定了RhoA在对虾抗细菌免疫中发挥重要的功能，并进一步丰富了小GTP酶在多种细胞生命活动中发挥调控功能的理论知识。 2.对虾抗病毒训练免疫的诱导与机理研究 适应性免疫具有免疫记忆性，而先天免疫不存在记忆性。然而越来越多的研究表明先天免疫同样存在记忆性，我们称之为训练免疫。在高等动物中，训练免疫广泛存在;无脊椎动物缺乏适应性免疫，先天免疫应答便成为宿主抵御病原感染的关键方式，虽然已经有研究表明无脊椎动物先天免疫同样存在记忆性，但无脊椎动物的训练免疫应答缺乏相关分子机理的研究。在本研究中，我们发现紫外灭活WSSV与一种WSSV囊膜蛋白VP28均可以诱导训练免疫，通过这两种物质的致敏可以增强对虾的存活率并抑制对虾体内病毒感染;转录组测序结果显示两种物质诱导的训练免疫可以诱导多种基因差异表达，包括吞噬相关基因、自噬相关基因，Toll信号通路、Ras信号通路等基因。通过分子生物学与生物信息学分析，我们确定了灭活WSSV与WSSV单一组分VP28可以通过调控一系列信号通路来影响宿主的免疫应答水平并诱导产生训练免疫。本研究在无脊椎动物中发现病毒单一组分可以诱导宿主的训练免疫，确定了先天免疫存在记忆性的同时丰富了无脊椎动物先天免疫的理论知识。
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