摘要
背景:Toll样受体(toll-like receptor,TLRs)在启动炎症反应中的作用日益受到重视。TLRs通过识别PAMPs而激活先天性免疫反应途径，并诱导适应性免疫反应的发生。现哺乳动物中共发现了13种Toll样受体，其中TLR4是启动炎症反应的“门户”蛋白，是目前哺乳动物唯一将细胞外抗原信息向细胞内传递的并引发固有免疫炎症反应的源头跨膜蛋白，是机体炎症反应链的起始点和调控点。TLR2参与对物理、化学及缺血等非感染因素所致的细胞坏死的识别和炎症反应。TLR2/4广泛分布于单核巨噬细胞系统、内皮细胞、树突细胞等免疫细胞，其激活将引起一系列下游分子的活化，并活化核因子kappa B(nuclear factor，NF-κB)、AP蛋白(acute phase protein，AP)等，最终引起以TNF-a、IL-1等为中心的促炎症因子激活，放大炎症效应，导致多种炎症因子的瀑链式释放。肝脏的缺血/再灌注(I/R)是在休克的复苏、肝叶切除术以及肝移植手术等过程中常见的病理生理过程。肝脏缺血再灌注不仅可以引起肝脏组织的损伤，还可以在发病早期即可引起心、肺、脑、肾、肝等多器官功能不全，严重时发展到全身炎症反应综合症，甚至多器官功能衰竭(MODS)，成为患者的主要致死原因之一。肝脏的缺血/再灌注早期的全身炎症反应综合征若得不到及时和正确的治疗会进一步发展导致包括肺、心、肝、肾及循环系统等脏器或系统的损伤，甚至衰竭而使患者死亡。早期器官损伤中以急性肺损伤(ALI)最多见，严重时可发展成急性呼吸窘迫综合征(ARDS)。巨噬细胞是产生炎性细胞因子(proinflammatory cytokines)的重要细胞，在全身炎症反应中起重要作用。本研究探索肺泡巨噬细胞Toll样受体2、4在小鼠肝脏缺血再灌注肺损伤中的作用，并对其在肺损伤中的机制进行研究。 目的:探讨肺泡巨噬细胞Toll样受体2、4的表达与肺功能损伤的关系，阐明Toll样受体2、4在小鼠全肝脏缺血再灌注损伤所致肺功能损伤中的作用和机制。 方法:将BALB/c小鼠随机分成两组:缺血再灌注损伤组(I/R group)和假手术对照组(Sham group，SH group)，建立小鼠全肝脏缺血再灌注损伤模型。运用荧光实时定量PCR(Real time PCR)及western blot方法检测缺血再灌注过程不同时间点肺泡巨噬细胞TLR2、4的表达，并动态观察小鼠肺功能及炎症因子的变化。进一步通过体内实验探讨相应机制:采用野生型(C3H/HeouJ)和TLR4功能缺失型(C3H/HeJ)小鼠复制全肝缺血再灌注损伤模型，观察肺泡巨噬细胞Toll样受体4的表达对肺损伤程度的影响;探讨肺泡巨噬细胞表面Toll样受体2在小鼠全肝缺血再灌注损伤肺组织中的激活与TLR4的关系及其对肺损伤的影响。为进一步探讨TLR4对TLR2表达的影响及其参与I/R损伤的信号途径，通过体外实验观察针对Toll样受体4mRNA的发夹结构RNA(small haparin RNA，shRNA)真核表达载体pEGFP/TLR4-siRNA诱导的RNA干扰对内毒素刺激下小鼠巨噬细胞株RAW264.7细胞Toll样受体2的表达影响;观察NF-κb抑制剂N-乙酰半胱氨酸(NAC)对脂多糖(LPS)诱导RAW264.7细胞TLR2/4表达的影响。 结果:1、TLR4及TLR2参与肝脏I/R肺损伤:随着肝脏I/R时间的延长，BALB/c小鼠I/R组肺损伤加重，肺组织湿干重比值持续升高，肺组织髓过氧化物酶(MPO)的含量1h后急剧增加，在6～12达到峰值(P＜0.05)。I/R组支气管肺泡灌洗液中肿瘤坏死因子(TNF-a)的水平6h最高(P＜0.01)。I/R组各时间点肺泡巨噬细胞Toll样受体2/4蛋白及mRNA表达升高，TLR2表达水平持续升高，TLR4在6h达到峰值(P＜0.01或者P＜0.05)。 2、肺泡巨噬细胞表面TLR4激活可能上调TLR2的表达，加重鼠全肝I/R肺损伤:与假手术组相比，在全肝I/R过程中，野生型小鼠(C3H/HeouJ)肺组织湿/干重比值持续升高，MPO的含量持续增加(P＜0.05)，支气管肺泡灌洗液中TNF-a的水平明显升高。且C3H/HeouJ小鼠TLR2/4mRNA表达升高，TLR4mRNA在6h升高达峰值，TLR2mRNA表达相对量持续升高;TLR4蛋白表达亦升高，6h强于1h，C3H/HeJ小鼠在再灌注后TLR2mRNA的表达仅轻度升高(P＜0.05)，各时间点均低于小鼠C3H/HeouJ小鼠表达水平(P＜0.01)。与C3H/HeouJ小鼠相比，C3H/HeJ组小鼠在再灌注后支气管肺泡灌洗液中TNF-a的含量明显降低(P＜0.05)，肺损伤明显减轻(P＜0.05)，肺组织湿/干重比值及MPO的含量明显下降(P＜0.05)。两组小鼠缺血再灌注后1h肺泡灌洗液中内毒素水平与假手术组比较，差异无统计学意义(P＞0.05)，而在6h时则明显升高，差异有统计学意义(P＜0.05)。 3、体外实验提示内毒素刺激下巨噬细胞TLR2表达的上调可能通过TLR4/NF-κB信号途径介导:将pEGFP/TLR4-siRNA稳定转染至RAW264.7细胞后，增强型荧光蛋白的表达率约为(45.25±9.23)％。LPS刺激稳定转染TLR4-siRNA的RAW264.7细胞后，TLR2mRNA及蛋白的表达明显低于未转染TLR4-siRNA者，NF-κB p65表达及TNF-a水平亦下调。以NAC干预后，相同时间点TLR2/4mRNA及TNF-a水平较无NAC干预LPS对照组显著下降(P＜0.05)。 结论:小鼠全肝脏缺血再灌注时肺功能发生损伤;肺泡巨噬细胞表面Toll样受体2/4在小鼠肝脏缺血再灌注后被激活，参与了肺损伤的过程。内毒素刺激TLR2表达上调可能由TLR4/NF-κB信号途径介导，从而进一步加重小鼠全肝脏缺血再灌注肺损伤的过程。
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