摘要
虾青素是一种叶黄素类胡萝卜素，存在于微生物与海洋动物中，特殊的分子结构使它具有很强的抗氧化能力，其广泛应用在食品、饲料、营养保健品和药品等方面。虾青素强大的生理功效引起研究者们的普遍关注，研究主要集中在虾青素的产率和生产方式这两方面。目前主要是采用雨生红球藻(Haematococcus pluvialis)培养技术来生产虾青素，但培养过程中对雨生红球藻的生长条件及其苛刻，培养周期长，并且虾青素的累积与藻细胞生物量的累积之间存在矛盾使得利用雨生红球藻高效生产天然虾青素受到一定的限制。因此，如何摆脱雨生红球藻培养困难、缩短培养时间仍是目前虾青素生产过程需要重点研究的问题。本论文将钝顶螺旋藻FACHB-904中β-胡萝卜素羟化酶基因(SpcrtR)编码蛋白(SpCRTR)在酿酒酵母中分泌表达，利用发酵技术将螺旋藻与重组酿酒酵母菌株进行培养，SpCRTR利用螺旋藻中虾青素代谢前体角黄素，最终催化其形成虾青素，与雨生红球藻的培养相比，这一培养路线不仅缩短培养时间，而且摆脱了培养过程中条件的限制。 首先，克隆获得SpcrtR基因并且对其编码蛋白进行了生物信息学分析。通过SpcrtR基因在原核中的表达探索SpCRTR的催化功能。其次，将SpcrtR转化到野生型酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中，实现SpCRTR真核表达，获得重组酿酒酵母菌株。再次，利用发酵技术将螺旋藻与重组酵母菌株进行培养，试验通过HPLC的方法定性定量分析了发酵液中虾青素累积的情况。利用有机溶剂萃取和硅胶柱层析结合的方法提取与纯化发酵液中的虾青素。最后，利用细胞工程手段将纯化后的虾青素作用于H2O2受损巨噬细胞RAW264.7，通过检测抗氧化相关酶的指标证明纯化后的虾青素对巨噬细胞RAW264.7的抗氧化能力。利用细胞形态学观察、线粒体膜电位变化以及分子生物学手段检测凋亡基因caspase-3和caspase-9mRNA表达水平来验证虾青素抗细胞凋亡能力。 本研究主要结果如下: (1)从钝顶螺旋藻FACHB-904中克隆获得β-胡萝卜素羟化酶基因SpcrtR，其全长为906bp，编码一个301个氨基酸残基，分子量为28kDa，分子式为:C1652H2435N425O399S8，等电点(pI)为8.90。生物信息学分析表明，SpCRTR中存在6个跨膜结构域，不同物种中β-胡萝卜素羟化酶氨基酸序列同源性较高并且具有2个高度保守的组氨酸结构域:“HXXXXH”和“HXXHH”。此外，SpcrtR与蓝细菌中该基因的亲缘关系比较近，与高等植物中的该氨基酸亲缘关系相对比较远。 (2)成功构建表达载体pGEX-6p-1-SpcrtR，与pACCAR16△crtX共转化到原核宿主中，通过SDS-PAGE和Western Blotting蛋白分析初步判断SpCRTR在原核宿主中已成功表达。对大肠杆菌中类胡萝卜素提取液进行HPLC分析检测，结果表明SpCRTR将β-胡萝卜素催化生成了玉米黄质，进一步说明SpCRTR蛋白具有β-胡萝卜素羟化酶的催化功能。 (3)在酿酒酵母表达系统中，成功构建pYES2/NT-A-S-SpcrtR酿酒酵母表达载体，通过SDS-PAGE和Western Blotting蛋白检测，证明SpCRTR在酿酒酵母中成功表达。试验筛选获得重组酿酒酵母S7菌株，螺旋藻与其发酵后实现了虾青素从无到有的转化，试验结果显示发酵液中添加4％的螺旋藻，发酵18h后虾青素含量最高，发酵前角黄素的浓度为0.24±0.07μg/mL，发酵后溶液中没有角黄素，虾青素的含量为0.25±0.02μg/mL。其次利用有机溶液萃取和硅胶层析柱的方法分离提取纯化虾青素后，虾青素的浓度为7±0.28mg/mL。 (4)建立巨噬细胞264.7H2O2氧化损伤模型后，在虾青素施药浓度为40μM时，比致损后的巨噬细胞264.7MDA活力下降了61.78％(P＜0.01)。当虾青素的浓度为20μM时，其具有显著恢复SOD活性的作用，提高了SOD高达31.44％(P＜0.01)，说明纯化后的虾青素具有抗氧化功能。虾青素可以阻止细胞形态受损并且阻止细胞线粒体膜电位变化，同时虾青素可能通过线粒体凋亡途径，抑制caspase-3和caspase-9mRNA表达，从而保护和防止细胞凋亡。
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