摘要
芍药（Paeonia lactiflora Pall.）是我国的传统名花，因性喜冷凉干燥，多分布或栽培在我国华北、东北、西北和西南地区。近年来，随着芍药在园林花境景观中的广泛应用和芍药高档切花市场的兴起，浙江杭州、江苏扬州和上海等“长三角”地区纷纷从山东菏泽、河南洛阳等北方主产区开展“芍药南移”工作。然而，由于我国江南地区夏季高温持续时间长，使得大多数优良芍药品种“南移”后出现生长不良、难以展现原产地的优良观赏性状。夏季高温已然成为限制芍药切花在南方规模化生产及其在园林景观中广泛应用的主要因素之一，而找到调控芍药耐高温能力的关键基因对于培育耐高温能力强的芍药品种至关重要。为此，本研究克隆了芍药HSP70基因并对其序列进行生物信息学分析，通过表达模式、原核表达、亚细胞定位等研究明确芍药HSP70基因的表达特性，构建芍药HSP70基因的超表达载体并遗传转化拟南芥、观察高温胁迫对转基因植株的影响，从而深入了解芍药HSP70基因在调控芍药耐高温能力方面的功能。主要结果如下: (1)通过RACE技术克隆了芍药HSP70基因的cDNA全长序列，该基因长2195bp，具有5'非编码区(70bp)、起始密码子、完整的开放阅读框(1953bp)、终止密码子、3'非编码区(175bp)和poly(A)尾巴(12bp)，共编码650个氨基酸，与已报道的其他植物HSP70基因核苷酸和氨基酸序列同源性较高，该基因登录号为JN180465，并将其命名为PlHSP70。 (2)通过PCR扩增获得了PlHSP70基因的DNA序列，该序列长为3636bp，包含2个外显子和1个内含子，并且内含子序列符合“GT-AG”剪切规律，该基因登录号为MF817498。随后，通过构建的重组质粒在大肠杆菌中表达明确了PlHSP70蛋白分子量约为71kD;通过构建PlHSP70-GFP融合瞬时表达载体、转化水稻原生质体对其进行亚细胞定位，明确了PlHSP70基因定位于细胞质中。 (3)通过qRT-PCR技术检测了PlHSP70的表达模式，在高温胁迫下，PlHSP70的表达水平随着胁迫时间的延长而逐渐增加，其表达模式与植株中REC、H2O2和O2-积累水平、MDA含量的趋势相一致，而与叶片中相对含水量的趋势相反。 (4)构建了以PlHSP70基因为目的基因的过量表达载体pCAMBIA1301-PlHSP70，采用冻融法将其转化农杆菌EHA105，并通过农杆菌介导的floral-dip法侵染拟南芥，将收获的T0代种子在含有抗生素的MS培养基上进行初步筛选，得到转化的T1代拟南芥。同时，通过GUS染色及PCR扩增共同鉴定了转PlHSP70基因拟南芥株系。 (5)在高温胁迫下，转PlHSP70基因拟南芥植株较野生型拟南芥WT的耐高温能力更强，植株生长良好，叶片并未出现黄化、卷缩的症状;Fv/Fm、Y(Ⅱ)、qN和ETR等叶绿素荧光参数在转PlHSP70基因拟南芥植株均相对较高;叶片相对含水量在转PlHSP70基因拟南芥植株中较高，而H2O2、O2-积累较少，REC较低，AtCu/ZnSOD、AtCAT和AtAPX3个保护酶基因的表达水平相对较高;此外，转PlHSP70基因拟南芥植株叶片的细胞结构更为完整，具有较多的叶绿体和淀粉粒及较少的脂质球体。
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