摘要
背景和目的: 生殖道高危型人乳头瘤病毒(human papillomavirus，HPV)的感染是导致宫颈癌及癌前病变发生的必要生物学因素。高危型HPV的致癌性主要与其早期基因区的两个病毒癌基因E6、E7的功能相关。E6、E7可分别通过促进抑癌基因p53和Rb的蛋白降解而诱导正常细胞永生化并发生癌变。临床上感染率最高的是HPV16，也是宫颈癌及癌前病变患者中最常见的高危型别，研究药物对HPV16阳性细胞的抑制作用及相关作用机制对于筛选有效清除高危型HPV病毒感染细胞的药物、阻断继发宫颈癌及癌前病变的发生和发展具有非常重要的代表意义。鸦胆子油是苦木科植物鸦胆子的干燥成熟果实经提取得到的脂肪油，用其制成的鸦胆子油乳(Brucea Javanica oil emulsion，BJOE)是一种目前已应用于临床治疗某些晚期恶性肿瘤的纯中药制剂，对正常细胞无损害。近来有研究报道鸦胆子油可能对某些人乳头状瘤病毒感染相关疾病具有一定的治疗作用，提示其在防治与高危HPV病毒感染密切相关的宫颈疾病方面可能具有相当大的潜在应用价值。但国内外尚未见有关鸦胆子油乳对HPV高危型别阳性细胞的作用及其相关机制的研究报道。本研究选择HPV16阳性的人宫颈鳞状上皮永生化细胞系(Ect1/E6E7)与人宫颈癌CaSki细胞系分别作为宫颈癌前病变与宫颈癌的体外实验模型。通过观察鸦胆子油乳在体外对Ect1/E6E7和CaSki细胞增殖及细胞凋亡的影响，并进一步从基因和蛋白表达水平分别对鸦胆子油乳在体外对HPV16病毒癌基因E6、E7及相关抑癌基因p53、Rb的影响进行研究以探讨其可能的作用机制，以期明确鸦胆子油乳对HPV16阳性细胞的体外生长抑制作用及其可能作用机制，为早日筛选出能有效清除高危型HPV病毒感染细胞的药物，并为进一步防治与其持续性感染密切相关的宫颈病变的发生、发展提供实验基础与理论依据。 方法: 1.细胞生长形态学观察:常规体外培养HPV16阳性的Ect1/E6E7和CaSki细胞，倒置显微镜下动态观察Ect1/E6E7和CaSki细胞在不同浓度鸦胆子油乳(5μg/mL、10μg/mL、20μg/mL、40μg/mL、80μg/mL)体外作用不同时间(24h、48h、72h)发生的形态学改变，并与无药物作用细胞的生长形态相比较。 2.细胞生长抑制分析:采用MTT法检测不同浓度鸦胆子油乳(5μg/mL、10μg/mL、20μg/mL、40μg/mL、80μg/mL)在体外作用不同时间(24h、48h、72h)对Ect1/E6E7和CaSki细胞的增殖影响（以OD值表示），并与对照组OD值相比较，同时计算细胞生长抑制率以分析鸦胆子油乳对HPV16阳性细胞的生长抑制情况。 3.细胞凋亡分析:(1)采用Hoechst33258细胞核染色法于荧光显微镜下观察Ect1/E6E7和CaSki细胞在20μg/mL鸦胆子油乳作用48h后发生的细胞凋亡形态学变化。(2)采用流式细胞仪AnnexinⅤ-FITC/PI双染色法检测不同浓度鸦胆子油乳(5μg/mL、10μg/mL、20μg/mL)体外作用48h对Ect1/E6E7和CaSki细胞凋亡率的影响。 4.RT-PCR分析:采用RT-PCR法半定量检测各不同浓度鸦胆子油乳(5μg/mL、10μg/mL、20μg/mL)体外作用48h对Ect1/E6E7和CaSki细胞HPV16E6、E7基因mRNA相对表达量的影响，并与对照组比较分析。 5.免疫细胞化学分析:采用免疫细胞化学染色（Elivison二步法）检测各不同浓度鸦胆子油乳(5μg/mL、10μg/mL、20μg/mL)体外作用48h对Ect1/E6E7和CaSki细胞HPV16E6、E7及p53、RB基因蛋白的表达影响，并采用MIQAS医学图像定量分析系统行免疫组化阳性指数比较。 结果: 1.倒置显微镜下动态观察结果显示，与未加药组比较，Ect1/E6E7和CaSki细胞在鸦胆子油乳的作用下均表现出细胞数量减少、生长密度减小、形态皱缩、细胞颗粒及碎片增多等生长抑制的改变，并且随着药物浓度的增加及作用时间的延长，细胞形态学改变更为明显。 2.MTT法检测结果显示，不同浓度鸦胆子油乳对Ect1/E6E7细胞与CaSki细胞的体外增殖能力均具有抑制作用，呈明显的浓度与时间依赖性，并且药物对细胞的体外抑制作用均存在浓度和时间的交互作用。 3.Hoechst33258细胞核染色荧光显微镜下观察结果显示，未经鸦胆子油乳体外作用的Ect1/E6E7与CaSki细胞核呈圆形或椭圆形，荧光微弱、呈弥散性。而经20μg/mL鸦胆子油乳体外作用48h后，细胞核内见到浓染、致密、呈颗粒块状的蓝色荧光，提示有细胞凋亡发生，并形成凋亡小体。 4.流式细胞仪AnnexinⅤ-FITC/PI双染色法检测结果显示，经5μg/mL鸦胆子油乳体外作用48h后，凋亡细胞开始增多，随着药物浓度逐渐增加(10μg/mL、20μg/mL)细胞凋亡率逐渐增高。各不同药物浓度组与对照组比较，细胞凋亡率均明显增加，差异有显著统计学意义(P＜0.01)。除CaSki细胞10μg/mL组细胞凋亡率与5μg/mL组比较未发现明显差异外（P＞0.05），其他各不同药物浓度组间两两比较差异均有统计学意义(P＜0.05或P＜0.01)。 5.RT-PCR检测结果显示，各不同浓度鸦胆子油乳体外作用Ect1/E6E7细胞与CaSki细胞48h后HPV16E6与E7基因mRNA的相对表达量与对照组（无加药组）相比均明显减低(P＜0.05或P＜0.01)。除Ect1/E6E7细胞HPVE6基因mRNA在5μg/mL组与10μg/mL组间比较及E7基因mRNA在10μg/mL组与20μg/mL组间比较未发现明显差异外（P＞0.05），其他均随药物浓度的增高差异愈加明显(P＜0.05或P＜0.01)。 6.免疫细胞化学分析结果显示，HPV16E6蛋白阳性主要为细胞浆着色，HPV16E7、P53（突变型）及Rb蛋白阳性主要为细胞核着色。在未经鸦胆子油乳体外作用的Ect1/E6E7细胞与CaSki细胞中可见HPV16E6、E7蛋白及P53蛋白（突变型）的阳性表达，而Rb蛋白的表达微弱。各不同浓度鸦胆子油乳体外作用Ect1/E6E7细胞与CaSki细胞48h后HPV16E6、E7蛋白及P53蛋白（突变型）表达呈逐渐下降的趋势，而Rb蛋白的表达逐渐升高，与对照组（无加药组）相比差异均具有显著统计学意义(P＜0.01)。 结论: 鸦胆子油乳在体外对HPV16阳性细胞具有明显的抑制作用，可导致HPV16阳性的宫颈永生化Ect1/E6E7细胞与宫颈癌CaSki细胞的体外生长抑制及细胞凋亡增加。其作用机制可能为鸦胆子油乳通过下调病毒癌基因E6、E7的表达而抑制对细胞周期调控基因p53、Rb蛋白的降解及诱导作用，激活p53和Rb通路，从而诱导HPV16阳性细胞凋亡的发生和促进细胞死亡。实验结果提示鸦胆子油乳对高危型HPV阳性细胞具有生长抑制作用，为进一步将其应用于临床治疗高危HPV感染及相关宫颈病变的研究提供了一定的实验基础和理论依据。
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