摘要
百合是著名的球根花卉，具有较高的观赏、食用和药用价值。百合鳞茎在发育成熟时会逐渐进入休眠状态，未解除休眠的百合鳞茎在种植后会出现发芽率不高和盲花现象。ARF基因的表达会影响蔗糖磷酸合成酶的活性，参与生长素的合成，促进植物的发育，ArfGTP酶激活蛋白会影响生长素的极性运输。本研究以细叶百合鳞茎为试验材料，分析休眠解除过程中的四个重要时期淀粉和蔗糖酶活性变化，以及ARF基因的表达，克隆ArfGTPase激活蛋白LpAGD14基因，并进行生物信息学分析及植物表达载体构建，为后续的功能验证奠定基础。主要试验结果如下： 1、休眠期、萌动期、芽迅速增长期、出芽期4个时期的淀粉酶、淀粉磷酸化酶、蔗糖合成酶、蔗糖磷酸化酶的活性分析结果表明，在鳞茎低温储藏初期，淀粉代谢相关酶活性不高，是该时期百合鳞茎休眠程度较高，新陈代谢活动缓慢，可溶性碳水化合物消耗水平低，淀粉转化成可溶性糖的速率低，导致初期蔗糖磷酸合成酶活性升高，促进蔗糖磷酸合成蔗糖。在休眠开始解除至完全解除的时期，新陈代谢活动迅速，相关酶活性升高，可溶性糖消耗快，蔗糖酶合成酶活性达到最大。外层鳞片淀粉酶普遍高于内层鳞片，说明内层鳞片的新陈代谢活动低于外层鳞片。 2、从细叶百合转录组等得到69个ADP核糖基化因子（ARF）相关基因，通过生物信息学分析，发现这些基因主要参与氨基酸代谢，辅酶合成，糖代谢，信号转导等生物过程。选取上调表达的15个基因，设计特异性引物，以低温储藏四个时期的细叶百合鳞茎cDNA为模板，进行实时荧光定量试验，验证这些基因在4个不同休眠时期的表达。试验结果发现，所有基因在四个时期的表达量均呈上升趋势，储藏初期休眠程度最高，基因表达量最低，休眠完全解除时，相关基因表达量最大，说明这些基因为上调基因，有进一步研究的意义。 3、从细叶百合cDNA中克隆的LpAGD14基因属于ARF基因家族，具有典型的ArfGAP保守结构域，通过蛋白功能预测，发现其与油棕、芭蕉和芦笋等多种植物的GTP激活蛋白AGD14基因具有较高的同源性，推测出该蛋白属于Arf类GTP酶激活蛋白，能够调节生长素极性运输、囊泡运输和根发育，为进一步研究ARF基因的功能奠定基础。 4、构建植物表达载体pBI121- LpAGD14-GFP，利用高压基因枪法将此GFP融合蛋白打入洋葱表皮细胞内做瞬时表达，发现在洋葱表皮细胞的的细胞膜和细胞核中均有绿色荧光，表明LpAGD14基因在细胞膜表达。构建植物表达载体pCXSN- LpAGD14，利用农杆菌介导法将此载体转入野生型拟南芥中获得抗性植株，通过初步PCR鉴定，证实了该外源基因已成功转入到拟南芥的基因组中。
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