摘要
目的： 1.通过构建急性心肌梗死大鼠以及家兔模型，探讨骨髓间充质干细胞释来源的外泌体，对急性心肌梗死动物模型的治疗作用，并重点研究大鼠骨髓间充质干细胞来源的外泌体对于心肌梗死后心脏表面血流的改善情况，直观评价治疗前后心脏血流灌注情况变化。 2.探讨骨髓间充质干细胞来源的外泌体干预急性心肌梗死动物模型后对RAS系统、细胞凋亡等相关通路的影响。 3.探讨骨髓间充质干细胞来源外泌体对特定条件损伤下H9C2细胞的保护作用，以及对细胞凋亡等相关通路的影响。 方法： 1.分离、培养大鼠骨髓间充质干细胞至第三代，经鉴定后诱导骨髓间充质干细胞释放并收集外泌体，对外泌体进行粒子大小、表面抗原、形态学鉴定。 2.动物实验分组：①实验大鼠分组：健康的12周龄SPF级雄性SD大鼠，随机分组：A.空白对照组（Nor组）；B.心梗模型组7天/28天组（MI7d/28d组）；C.骨髓间充质干细胞治疗7天/28天组（BMSC7d/28d组）；D.外泌体治疗7天/28天组（EXOSOMES7d/28d组）。每实验组各15只。②实验家兔分组： A.空白对照组（Nor组）；B.心梗模型组7天/28天组（MI7d/28d组）。C.外泌体治疗7天/28天组（EXOSOMES7d/28d组）。每实验组各5只。各治疗组大鼠以及家兔均在急性心肌梗死模型造模成功后立即通过尾静脉（家兔为耳缘静脉）注射外泌体（或干细胞），模型对照组注射等量PBS。通过左心室压力测定、心脏血流灌注量以及血流图像检测、病理组织切片HE染色以及Masson染色、计算心梗面积以及纤维容积分数等方法，评估治疗前后心脏功能以及心脏血流灌注、梗死面积等情况。 3. ELISA方法检测各组大鼠血浆BNP、VEGF、ACE、ACE2、AngII、Ang1-7等因子浓度水平。 4.外泌体作用于H9C2心肌细胞，予特定条件损伤及作用于H9C2心肌细胞，采用CCK8、流式检测细胞凋亡率、Western-blot检测凋亡蛋白表达等方法，评估外泌体对H9C2细胞影响作用。 结果： 1.大鼠心脏血流灌注测定结果：大鼠发生心肌梗死28天后，EXOSOMES组以及BMSC组缺血区域较心肌死对照组减小（P＜0.05）。EXOSOMES组与BMSC组之间缺血区域相比，无统计学差异（P＞0.05）。 2.左心室穿刺测量法各组大鼠左心室压力检测结果：大鼠发生急性心肌梗死28天后，EXOSOMES组和BMSC组Pmax值均较MI组升高（P＜0.05）， EXOSOMES组和BMSC组Pmin值均较MI组降低（P＜0.05）。颈总动脉插管测量法各组大鼠左心室压力检测结果：大鼠发生急性心肌梗死28天后， EXOSOMES组和BMSC组Pmax值较MI组明显升高（P＜0.05），EXOSOMES组LEVDP值较MI组降低（P＜0.01）。 3.家兔心脏彩超测定结果：MI组与Nor组比较，射血分数（EF）值下降，差异有统计学意义（P＜0.05），EXSOMES组与MI组比较，EF值升高（P＜0.05），与Nor组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。MI组与Nor组比较，左室短轴缩短率（FS）下降，差异有统计学意义（P＜0.001），EXSOMES组与Nor组比较，FS值降低（P＜0.05），与MI组比较，FS值升高（P＜0.05）。 4.心肌梗死面积及纤维胶原容积分数分析结果： BMSC28d组与MI28d组比较，心肌梗死面积减小（P＜0.05），EXSOMES28d组与MI28d组比较，心肌梗死面积减小（P＜0.01），BMSC28d组EXSOMES28d组之间差别无统计学意义（P＞0.05）。BMSC28d组与MI28d组比较，心脏组织胶原容积分数下降（P＜0.05），EXSOMES28d组与MI28d组比较，心脏组织胶原容积分数下降（P＜0.01），BMSC28d组EXSOMES28d组之间差别无统计学意义（P＞0.05）。 5. RAS系统相关因子浓度ELISA测定结果：MI28d组血浆ACE浓度较Nor组明显升高（P＜0.001），较MI7d组也明显升高（P＜0.001），EXOSOMES28d组血浆ACE浓度较Nor组明显升高（P＜0.001），较EXOSOMES7d组也明显升高（P＜0.001），但较MI28d组降低（P＜0.05）。EXOSOMES28d组血浆ACE2浓度较EXOSOMES7d组升高（P＜0.001），较MI28d组升高（P＜0.05）。MI7d组与Nor组比较，大鼠血浆AngII浓度升高，差别有统计学差异（P＜0.05）， MI28d组血浆AngII浓度较MI7d组下降（P＜0.05），EXOSOMES7d组与MI7d组比较，血浆AngII浓度降低（P＜0.05），其余各组间血浆AngII浓度差别无统计学意义（P＞0.05）。EXOSOMES28d组与MI28d组比较，大鼠血浆Ang-(1-7)浓度升高（P＜0.05）。 6. BNP浓度ELISA测定结果：MI3d组与Nor组比较，大鼠血浆BNP浓度升高（P＜0.05），MI28d组与Nor组比较，大鼠血浆BNP浓度明显升高（P＜0.01）， MI28d组与 MI7d组比较，大鼠血浆 BNP浓度升高(P＜0.05）,EXOSOMES28d组和MI28d组比较，大鼠血浆BNP浓度降低（P＜0.05）。 7. H9C2细胞损伤与保护实验结果：CCK8法测定细胞增殖活性，结果显示经外泌体处理后细胞与单纯H202损伤后细胞比较，细胞活性升高（P<0.01），流式细胞结果：对照组H9C2细胞凋亡率为（4.2??????）%，H2O2处理后细胞凋亡率为（10.72??????），与H202组相比，经过外泌体预处理后H9C2细胞凋亡率降至（7.720???????）%（P<0.05）。而在低氧条件下，外泌体共培养组（EXOSOMES组）细胞活性较对照组高（P<0.01）。AngII作用H9C2细胞实验结果：AngII组细胞活性较对照组下降（P＜0.001），而AngII+EXOSOMES组细胞活性较对照组降低（P＜0.01），较AngII组升高（P＜0.05）。 结论： 1.外泌体能改善心梗后心脏功能、改善心梗后心脏血流灌注、减小心梗面积、减轻组织纤维化程度、降低心梗后发生心力衰竭的可能。 2.外泌体治疗急性心肌梗死后对血浆RAS因子浓度产生影响，可能是ACE、ACE2激活后带来下游产物浓度的变化，而产物浓度变化可能通过反馈调节影响启动因子的浓度，而治疗后既影响RAS启动因子活化能力，更重要的是加速将不利因子向有利因子转化，形成持续性的心肌保护作用。 3.外泌体能提高特定条件损伤下H9C2心肌细胞活性，可改善AngII对H9C2细胞不利影响。
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