摘要
漆酶是一种多铜氧化酶，能够催化多种酚类物质氧化。漆酶催化底物广泛，在纸浆漂白、染料脱色和酚类物质检测等多个领域都有重要应用潜能。近年来人们研究发现位于芽孢杆菌芽孢外壁的 CotA蛋白具有漆酶活性，与其它来源的漆酶相比，CotA蛋白具有较高的热稳定性和耐碱能力、不容易失活，因而具有重要的研究意义和应用潜能。CotA蛋白难于获得，天然的CotA蛋白与芽孢外壁上的其它蛋白紧密结合，非常难于分离纯化且产量低。利用大肠杆菌胞内表达 CotA蛋白容易形成无活性的包涵体。本文利用毕赤酵母菌对cotA基因进行异源表达，以提高CotA蛋白的表达量，使其分离纯化更容易。克隆了枯草芽孢杆菌cotA基因开放读码框片段，cotA基因开放读码框包含1542 bp，编码513个氨基酸残基。构建了cotA基因毕赤酵母表达载体 pPICZαB-cotA，通过转化筛选得到能够分泌表达 CotA蛋白的毕赤酵母菌株，酵母菌培养基上清漆酶活性高达891.2 U/L，酵母培养基上清浓缩液经两步层析得到电泳纯CotA蛋白。研究了CotA蛋白的漆酶催化活性。pH和温度是影响 CotA蛋白漆酶活性和稳定性的重要因素。CotA蛋白催化底物2,2′-连氮-二(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)、丁香醛连氮和2,6-二甲基苯酚氧化的最适pH分别为4.6、6.6和6.8。CotA蛋白在酸性条件下不稳定，在pH7.0和9.0的缓冲液中放置7天后其漆酶活性是起始酶活的3.5倍和5.6倍，推测CotA蛋白可能是一种嗜碱性漆酶。CotA蛋白耐高温，CotA催化丁香醛连氮氧化的最适温度为80℃，在60℃和70℃条件下放置10 h后剩余酶是起始酶活的72%和57%。 本研究以靛蓝胭脂红为模型染料，研究了CotA蛋白催化靛蓝胭脂红脱色的能力和条件。利用响应面法优化 CotA蛋白催化靛蓝胭脂红脱色的最佳条件为pH8.6、温度60℃、染料浓度41.5 mg/L，在该条件下脱色反应45 min后染料脱色率达91.4%，表明CotA蛋白对靛蓝胭脂红有较好的降解脱色能力。CotA蛋白能够催化靛蓝胭脂红降解生成质荷比为216.07[M-Na]-的小分子化合物，该降解产物可能是4-氨基-3-羧基苯磺酸钠。为使CotA蛋白可以被连续重复利用，开发了一种新颖的酶固定化载体。利用灵芝孢子中空微球负载 Fe3O4纳米粒子制备了磁性中空微球，该微球是固定CotA蛋白的良好载体，其CotA蛋白负载量为75 mg/g，固定后的CotA蛋白活性回复率高达81%。固定化CotA蛋白比游离的CotA蛋白热稳定性高，并在外加磁场条件下可被快速分离收集。10 mg固定化CotA蛋白在1 h内催化50 mg/L靛蓝胭脂红脱色，染料脱色率达99%并且重复使用10次后酶活损失仅为25%，表明固定化 CotA蛋白对染料靛蓝胭脂红有较好的脱色效果和重复使用性。CotA蛋白具有胆红素氧化酶活性，能够催化胆红素氧化。CotA蛋白催化胆红素氧化的最适pH值为8.0、最适温度为60℃。在中性条件下CotA胆红素氧化酶酶活较稳定。CotA胆红素氧化酶具有高度的热稳定性，在90℃条件下放置7 h后，CotA胆红素氧化酶的酶活仅减少50%。CotA蛋白催化胆红素氧化的同时伴随着氧气的还原。研究发现 CotA蛋白修饰的石墨电极能够直接电催化氧气还原，CotA蛋白具有制备酶生物燃料电池阴极的潜能。CotA蛋白在无氧条件下能够直接电催化 H2O2还原，表明 CotA能够催化H2O2得电子还原生成水，有助于阐明 CotA催化氧气还原的机制。利用 CotA电催化 H2O2还原的性能制备了 H2O2酶生物传感器，该传感器检测H2O2的线性范围是0.05 mmol/L到4.75 mmol/L，检测限为3.1μmol/L，是CotA蛋白的一种新应用。
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