摘要
肠道微生物和宿主的免疫、代谢等诸多方面都有着密切的联系。然而在研究肠道微生物与宿主之间相互作用关系时，人类缺乏直接的工具来研究肠道中某一特定微生物的功能，如敲除或敲低肠道中某种微生物，从而确定特定微生物被降低或者清除后，所引起的相关生理学变化。噬菌体是也称为细菌病毒，可以特异性的侵染细菌从而让宿主菌裂解死亡，大量的烈性噬菌体可以有效的裂解宿主菌从而降低其丰度。本课题拟将噬菌体作为一种肠道细菌的敲除工具，用以敲除或敲低肠道环境中的特定宿主菌，从而实现对肠道微生物组的精确编辑。 本研究课题主要可以分为以下四个部分: 第一部分实验主要利用野生型MG1655为宿主菌从下水道污水中进行噬菌体的分离，经过连续的筛选，得到一株对野生型大肠杆菌MG1655具有侵染性的噬菌体。其噬菌斑大小大约为3-4mm左右。通过透射电镜观察，发现噬菌体Ep1具有六面体状头部以及可弯曲尾部，尾长140nm左右。根据噬菌体分类学鉴定，确定其属于长尾科噬菌体。并对该噬菌体进行了感染复数检测以及一步生长曲线检测。检测结果发现，该噬菌体最佳感染复数为0.001，潜伏期约为10min，繁殖周期大约是20min。进一步检测了该噬菌体对温度、pH、氯仿的敏感性等生理生化特性。发现其对温度敏感，在90℃状态下20min处理可使活性完全丧失，而对pH以及氯仿都有很好的耐受性。 第二部分主要利用两株噬菌体研究单一噬菌体以及混合噬菌体分别对单培养体系及混合培养体系中宿主菌的抑制情况，在研究过程中得到了如下结论:(1)在单培养体系中，两种噬菌体分别作用以及一起作用都只能在短暂的时间内控制细菌数量，而不能长时间控制;不同噬菌体单独作用时对宿主菌数量的控制情况不一样;两种噬菌体共同作用的结果要优于任何一种单一噬菌体作用的结果;(2)在混合培养体系中，Ep1不能很好的控制宿主菌的增长;而T4噬菌体以及两种噬菌体的混合溶液可以很好的控制宿主菌的增长，甚至会将宿主菌从双培养体系中完全清除，而且后续实验中宿主菌的数量没有增长。 本课题第三部分首先将含有GFP的质粒导入到野生型大肠杆菌MG1655中，然后通过抗生素处理将含有GFP质粒的MG1655定植于小鼠肠道内，建立宿主菌丰富的小鼠肠道模型。然后再饲喂小鼠高效价噬菌体悬液，在荧光显微镜下观察到定植含有MG1655的小鼠粪便处理样品中含有杆状细菌结构。而利用噬菌体处理的定植有MG1655小鼠粪便处理样品中并未发现杆状细菌结构。通过血球计数板计数分析，发现噬菌体可以将肠道中宿主大肠杆菌MG1655降低4到5个数量级。同时对不同处理小鼠进行16S rDNA多样性检测分析，通过分析发现抗生素处理对小鼠肠道内微生物的多样性影响很大，其可以显著降低肠道菌群多样性。而且单纯的噬菌体悬液灌胃处理也会对肠道中微生物群落结构存在一定的冲击作用。但是噬菌体对肠道菌群多样性的影响远小于抗生素。加入大肠杆菌并同时加入噬菌体组（处理组D）与只加入噬菌体组（F组）之间的菌群结构并没有显著差异。后续实验通过组间物种主成份分析比较不同组别之间物种组成差异。结果显示不同处理组的主成份之间明显存在差异。 第四部分主要利用Pacbio测序平台对具有噬菌体抗性菌株进行测序。得到其完整的基因序列图谱，并用Circus软件绘制该细菌基因圈图。通过测序发现，该菌株的基因总长度为4833062bp，一共含有4636个基因序列。具体基因序列已提交NCBI，序列号为CP026085。对该测序菌株进行生物信息学分析，得到如下发现:(1)发现9个CRISPR序列，其中2个为确定的CRISPR序列，而剩余7个为疑似CRISPR序列。(2)找到6个前噬菌体序列。将这些前噬菌体序列与数据库中序列进行比对，发现所对应的噬菌体序列在NCBI中的编号分别为:PHAGE Entero Sfl01NC027398、PHAGE Escher pro483NC028943、PHAGE Entero lambda NC001416、PHAGE Salmon Fels2NC010463。(3)一共预测得到50个GI岛，并且将其绘制成为基因岛图。(4)将测序菌株基因组序列与大肠埃希氏菌K12substr.MG1655菌株以及DH10B菌株通过blastn进行全基因组序列比对。对差异基因进行分析筛选，将与噬菌体侵染以及抵抗不相关基因删除。得到噬菌体菌株所特有基因55个，这些基因中主要包括ABC转运家族相关基因、膜表面受体、分泌系统相关蛋白基因、以及铁离子转运系统相关蛋白基因。得到噬菌体抗性菌株所特有基因97个，在所有的特异性基因中，一共找到限制性内切酶以及甲基化酶共12个，其中3个与REBASE数据库中预测得到的RM序列一致，还有2个上述3个RM序列紧密连锁，可能共同发挥功能。并找到4个毒素抗毒素系统相关基因，其可能参与到噬菌体的抵抗机制之中。剩余基因主要为一些ABC转运系统相关基因、孔道蛋白和细胞膜上的转运体，这些基因所编码的蛋白可能与噬菌体与宿主菌相互作用有关。
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