摘要
研究目的： 长期的营养过剩和身体活动的缺乏导致肥胖、IR、T2DM等代谢性疾病的日趋流行，骨骼肌 IR是造成全身IR及各种代谢性疾病的主要因素之一。有氧运动可有效改善IR，已被广泛用于临床代谢性疾病的预防和治疗，然而其调节机制尚不完全清楚。 Sesns是一类高度保守的应激诱导蛋白，可对抗氧化应激、保护细胞免于凋亡，在延缓机体衰老、预防及治疗癌症以及肥胖等一系列代谢性疾病的发生与发展过程中具有十分重要的作用。哺乳类和大多脊椎类动物的基因组主要表达3种Sesns亚型，无脊椎动物机体仅表达1种。尤其重要的是，Sesns参与细胞自噬激活，与AMPK/mTORC1信号通路关联密切。自噬作为普遍存在的分解代谢调节机制，通过清除胞内损伤或衰老的细胞器、过量ROS及能量代谢产物，不仅参与维持正常状态下细胞的代谢平衡，也在代谢性疾病发生过程中起着重要作用。AMPK/mTOR信号通路通过感受细胞内营养与能量水平变化，在调控机体能量代谢与稳态维持过程中至关重要。而且细胞可通过AMPK/mTOR信号通路对一些来源于生长因子、激素水平、营养状态、细胞外环境压力以及细胞内能量应激等一些分子信号的变化进行整合从而实现对细胞自噬水平的调节。作为能量代谢调节的关键介质，AMPK活化通过增强骨骼肌细胞葡萄糖摄取和氧化、增加脂肪酸的氧化率，同时抑制肌糖原合成和促进糖原的分解、抑制骨骼肌蛋白合成等途径，在运动过程中骨骼肌能量代谢的供应与机体内稳态维持调节中发挥着至关重要的作用，且与IR相关代谢性疾病的预防和治疗关系密切。有氧运动作为细胞自噬的天然“激动剂”，通过自噬激活在维持能量代谢和防治肥胖、T2DM等疾病方面有着独特的优势。 尽管目前运动与Sesns表达调控之间的关系并不明确，但Sesns涉及P53,AMPK,mTOR及过氧化物酶信号转导调节的重要过程，提示Sesns参与自噬激活和AMPK促进细胞能量代谢之间的潜在联系。并且，Sesns基因缺失引起的代谢表型改变与长期运动缺乏所致的代谢机能障碍极为相似。而且，单次抗阻运动及中、高强度的运动可激活细胞AMPK、增加Sesns上游效应蛋白P53的蛋白表达及磷酸化活性，改善增龄性心肌和骨骼肌功能退变而延缓衰老，表明Sesns可能参与运动促进健康的调节过程。此外，单次运动增加骨骼肌细胞Sesn2/3蛋白表达、抑制mTOR/S6K1通路活性，改善细胞胰岛素信号转导，然而有关长期有氧运动上调Sesns增强骨骼肌胰岛素敏感性与自噬的调节机制尚不明确。本研究综合在体和离体两方面，对 Sesn2/AMPK信号通路介导的有氧运动促进骨骼肌细胞自噬发生和胰岛素敏感性过程中的相关调控机制展开研究，为探寻IR,T2DM等代谢性疾病药物防治的作用靶点以及有效运动处方的建立提供理论依据。 本课题研究目的为： (1)明确有氧运动是否可以上调正常及IR小鼠骨骼肌细胞Sesns蛋白表达和自噬水平； (2)明确Sesns是否激活骨骼肌细胞自噬及改善高脂诱导的IR； (3)探讨Sesns是否依赖于AMPK激活自噬改善IR。 研究方法： 通过高脂饮食诱导小鼠IR，并结合AMPKα2基因敲除小鼠，进行有氧运动干预探讨小鼠骨骼肌组织代谢及细胞自噬的变化；同时进行离体肌管细胞培养诱导IR并做相关处理，探讨Sesn2/AMPK信号在骨骼肌细胞自噬和胰岛素敏感性调控及有氧运动改善IR中的作用机制。具体如下： (1)IR小鼠模型的建立与运动干预 将4周龄的雄性C57BL/6小鼠进行随机分出正常饮食组和高脂饮食组，分别饲以正常和高脂饲料16周，建立小鼠 IR模型；之后分别将各饮食组随机分出相应的安静组和运动组，运动组小鼠进行60min/天、强度为75%VO2max的6周有氧跑台训练。此外，6周龄的雄性野生型和 AMPKα2基因敲除小鼠分别分为安静组和运动组，运动组完成6周的有氧跑台训练。 (2)代谢表型的检测 采用OGTT检测小鼠葡萄糖耐量；ELISA法检测FINs和酶法测血脂水平；油红O染色法检测骨骼肌脂质沉积；称量体重并用小动物体成分仪测定小鼠体脂含量。 (3)指标检测 Western Blot检测骨骼肌组织和肌管细胞蛋白表达；2-NBDG法检测肌管细胞葡萄糖摄取水平；Real-time PCR检测基因表达。 (4)细胞培养及处理方案 以Palmitate孵育C2C12肌管细胞以诱导细胞IR；构建过表达Sesn2腺病毒(Ad-Sesn2)和过表达 AMPKα2-K45R显性负突变腺病毒(Ad-AMPKα2-DN)以感染肌管细胞；细胞自噬抑制采用3-MA；检测胰岛素信号通路蛋白表达及肌管细胞对葡萄糖摄取能力；用AICAR、过表达Sesn2和/或过表达AMPKα2显性负突变腺病毒处理肌管细胞，检测细胞自噬和胰岛素通路蛋白表达水平。 研究结果： (1)6周有氧运动显著降低小鼠由高脂饮食引起的体重和体脂的增加、改善机体糖耐量、减少骨骼肌脂质沉积、改善高脂饮食诱导的高胰岛素血症及脂质代谢异常； (2)16周高脂饮食显著抑制小鼠骨骼肌细胞Sesn2蛋白表达水平，而6周运动增加其表达；Palmitate孵育肌管细胞24小时诱导IR，伴随Sesn2蛋白表达显著下降； (3)过表达Sesn2显著增加IR肌管细胞对胰岛素介导的葡萄糖摄取；同时，抑制Palmitate对胰岛素信号蛋白pIRS1-S636/639和pIRS1-S307增强效应，而pAKT-S473和pAKT-T308蛋白表达显著增加； (4)Sesn2过表达显著增加IR细胞自噬相关因子Beclin-1,pULK1-S555蛋白表达和LC3II/I比值，而p62降低，提示Sesn2激活细胞自噬效应； (5)抑制细胞自噬显著增加Palmitate孵育诱导的pIRS1-S636/639蛋白表达、减少pAKT-S473表达，降低细胞对葡萄糖摄取；且过表达Sesn2未能改善Palmitate引起的pIRS1-S636/639增加和pAKT-S473表达下降及葡萄糖摄取抑制，提示Sesn2促进细胞葡萄糖摄取和改善胰岛素信号转导依赖于细胞自噬； (6)6周有氧运动使小鼠骨骼肌由高脂饮食抑制的AMPK磷酸化水平显著增加；肌管细胞过表达Sesn2则显著逆转Palmitate降低的AMPK磷酸化蛋白表达； (7)AICAR激活肌管细胞自噬；Ad-AMPKα2-DN显著降低自噬因子pULK1-S555蛋白表达和LC3II/I比值，p62积聚增加；AMPK失活显著加剧细胞Palmitate诱导的pIRS1-S636/639蛋白表达水平升高和pAKT-S473降低，而Sesn2过表达无论是对细胞自噬或胰岛素信号通路蛋白表达均无显著性影响，提示AMPK在Sesn2激活自噬改善高脂饮食诱导机体代谢紊乱中发挥必要作用； (8)与安静组相比，长期有氧运动对AMPKα2基因敲除小鼠骨骼肌pULK1-S555、p62蛋白表达水平和LC3II/I影响不显著；AMPKα2基因敲除运动组小鼠骨骼肌细胞LC3II/I比值和pULK1-S555蛋白表达显著低于野生型运动组，p62积聚增加，提示小鼠骨骼肌细胞AMPKα2在长期运动促进细胞自噬过程中发挥着十分重要作用。 研究结论： (1)长期高脂饮食诱导C57BL/6小鼠发生IR、抑制小鼠骨骼肌细胞自噬和Sesn2蛋白表达水平； (2)有氧运动有效改善高脂饮食诱导的小鼠糖、脂代谢异常与运动增加骨骼肌细胞自噬和Sesn2蛋白表达水平显著相关； (3)Sesn2通过AMPK激活骨骼肌细胞自噬改善高脂饮食引起的糖、脂代谢异常； (4)运动增加Sesn2蛋白表达在AMPK介导骨骼肌自噬、改善高脂饮食诱导机体IR过程中发挥重要作用。
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