共表达RA OmpA与鸭IL-2重组质粒的构建及免疫研究

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中文摘要：鸭疫里默氏杆菌（Riemerella anatipestifer；RA）病是由鸭疫里默氏杆菌感染引起的一种急性、高致病性传染病。目前已呈世界性流行，是严重危害养鸭业的主要细菌性传染病之一。RA的血清型众多，且不同血清型之间有少数存在有较低的交叉保护作用，再加上临床治疗抗生素药物的频繁滥用及用药量的不合理，导致RA易产生多重耐药性和食品卫生安全，因此给该病的防治带来了极大的困难。RA外膜蛋白A（OmpA）在不同血清型RA中均具有良好的免疫原性，可制成一种针对多血清型的RA疫苗；而IL-2具有免疫增强、免疫治疗及免疫预防等作用，在构建新型基因工程疫苗方面显现良好的应用前景。结合二者的优势，本实验将RA OmpA与鸭IL-2基因进行融合基因的构建及表达，构建真核表达重组质粒pcDNA3.1(+)-dIL-2-OmpA，将其免疫健康雏鸭后通过检测雏鸭的免疫指标，评价dIL-2-OmpA融合蛋白诱导雏鸭产生免疫效果，并探讨鸭IL-2对RA核酸疫苗的免疫增强作用，为将来研发安全、廉价、高效的新型RA疫苗奠定基础。 1.RA贵州株的分离鉴定及OmpA与16S rRNA基因的序列分析：为了解RA贵州分离株OmpA和16S rRNA基因序列的相关性以及与RA血清型分型之间的关系，本研究通过PCR技术对12株RA分别扩增OmpA和16S rRNA基因，对其构建系统进化树和分析其系统进化关系。结果显示，12株RA分离株OmpA基因分属在2个基因群，核苷酸和氨基酸序列同源性分别为96.9%-100%和98.4%-100%；OmpA蛋白中有规律的变异位点为100(R/G)、143(S/P)、145(T/I)和268(S/P)。12株RA分离株16S rRNA基因同属1个群，其核苷酸序列同源性为99.4%-100.0%。结果表明，12株RA贵州分离株OmpA和16S rRNA基因序列所属的基因群无明显相关性，并且与RA血清型的分型也无直接关联。 2.三穗鸭白细胞介素-2基因的克隆与序列分析：为了解三穗麻鸭dIL-2基因的分子差异和遗传变异水平，本实验根据GenBank发表的鸭dIL-2基因序列，设计并合成一对特异性引物，从刀豆蛋白A（ConA）诱导的三穗麻鸭颈外周血淋巴细胞中提取总RNA，通过RT-PCR方法扩增三穗麻鸭dIL-2基因并进行基因克隆与序列分析。测序结果表明，三穗麻鸭dIL-2基因编码区序列（CDS）全长为423 bp，共编码140个氨基酸，预测的分子式为C695H1125N175O226S13。序列分析发现，三穗麻鸭与绿头鸭、番鸭、绍兴麻鸭的IL-2基因核苷酸序列同源性最高（为98.3%）；与其它水禽IL-2蛋白氨基酸序列相比，在29(N/D)、32(K/T)、49(D/N)、58(T/K)、90(K/N)、105(M/T)、122(N/K)和129(Q/R)存在8处氨基酸位点变异，仅有L66、C68、E72和F127这4个氨基酸是三穗麻鸭和人与其它动物IL-2所共有保守位点。旨在为进一步研究dIL-2基因的生物学功能以及开发疫苗免疫佐剂奠定基础。 3.RA OmpA基因与dIL-2基因重组质粒的构建与鉴定：为了解RAOmpA与IL-2融合基因构建真核表达质粒的蛋白表达情况。本实验以RA贵州分离株血清2型OmpA基因和三穗麻鸭 dIL-2基因的克隆质粒DNA为模板，设计并合成带有linker的特异性引物，利用SOE-PCR方法扩增dIL-2-OmpA融合基因。将其插入真核表达载体pcDNA3.1(+)中成功构建pcDNA3.1(+)-dIL-2-OmpA融合表达质粒。通过脂质体将其转染禽细胞DF-1进行Western-blot检测发现，dIL-2-OmpA蛋白分子量为57 kDa。结果表明，融合表达质粒pcDNA3.1(+)-dIL-2-OmpA能够在真核细胞中表达，为后续的动物免疫试验研究提供了基础。 4.重组质粒pcDNA3.1(+)-dIL-2-OmpA对雏鸭感染RA的免疫保护研究：为了解重组质粒pcDNA3.1(+)-dIL-2-OmpA对雏鸭感染RA的免疫效力，本实验选取10日龄的三穗麻鸭70只，随机分成5组即pcDNA3.1(+)-dIL-2-OmpA组、pcDNA3.1(+)-OmpA组、pcDNA3.1(+)组、灭活疫苗组和空白对照组，在免疫后的不同时间段采集鸭血分离血清，应用间接 ELISA方法测定 RA抗体水平。同时选取血清1型和2型RA菌株测定毒力后分别进行攻毒保护试验。结果显示，重组质粒组和灭活疫苗组均能诱导免疫鸭产生RA抗体，其中pcDNA3.1(+)-dIL-2-OmpA组的抗体水平明显高于pcDNA3.1(+)-OmpA组，差异极显著（P<0.01）。以血清1型和2型 RA菌株分别进行感染试验鸭，pcDNA3.1(+)-dIL-2-OmpA组、pcDNA3.1(+)-OmpA组和灭活疫苗组的免疫保护率分别为66.67%和66.67%，33.33%和50%，83.33%和100%。结果表明，pcDNA3.1(+)-dIL-2-OmpA、pcDNA3.1(+)-OmpA均能产生免疫保护效果，其中dIL-2作为免疫佐剂对重组质粒pcDNA3.1(+)-dIL-2-OmpA在雏鸭体内的免疫起到免疫增强作用。重组质粒免疫雏鸭对血清1型和2型RA具有较弱的交叉免疫保护作用。本研究为将来研发安全、高效的新型RA佐剂疫苗提供参考依据。综上所述：本试验成功克隆了血清2型RAOmpA基因和三穗麻鸭dIL-2基因，并构建了真核表达质粒pcDNA3.1(+)-dIL-2-OmpA和pcDNA3.1(+)-OmpA免疫雏鸭，能刺激鸭体内产生RA特异性抗体，对血清1型和2型RA均有一定的交叉免疫保护作用，其中dIL-2作为免疫佐剂可以促进真核表达质粒pcDNA3.1(+)-dIL-2-OmpA的免疫保护效果。

作者：

雷云

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关键词：

鸭疫里默氏杆菌外膜蛋白A 融合蛋白白介素-2 免疫增强

授予学位：

硕士

学科专业：

预防兽医学

导师：

嵇辛勤

学位年度：

2017

学位授予单位：

贵州大学

语种：

中文

中图分类号：