摘要
目的：探讨临床分离的耐碳青霉烯类肠杆菌科细菌(CRE)的耐药机制,并从菌株、质粒和基因转移元件的分子遗传水平,系统地诠释blaNDM-5传播的分子机制,从而为临床抗生素治疗提供理论依据。 方法：收集2013年至2016年佛山市第一人民医院分离的对碳青霉烯类耐药非重复菌株共35株;MIC法检测这些菌株对常用抗生素的药物敏感性;三维试验和PCR法检测碳青霉烯酶和相对应的基因型;针对12株NDM-5阳性菌株,采用MLST分型方法检测菌株的克隆相关性;通过质粒接合试验检测NDM-5耐药基因的可转移性,并用PCR法对接合子的质粒不相容群进行分析;使用Ⅲumina Miseq测序平台和Pacific Biosciences公司开发的RSⅡ测序仪基于SMRT(Single Molecule Real Time)测序技术对临床分离的blaNDM-5阳性的沙门菌进行进行二代测序+三代测序,使用ResFinder、PlasmidFinder、ISFinder、MLST、NCBI Blast和Cgview等生物信息学软对测序拼接的序列进行分析;并采用PCR方法扩增其它11株NDM-5阳性肠杆菌科细菌blaNDM-5的侧翼序列,分析blaNDM-5的遗传环境。 结果：35株耐碳青霉烯类肠杆菌细菌对临床常用抗生素表现为多重耐药;三维实验和碳青霉烯类酶基因PCR结果显示,产金属酶的CRE菌株占85.71％(30/35),碳青霉烯类基因以blaNDM-1和blaNDM-5型为主;其中,blaNDM-5阳性株占36.36％(12/35);分别为大肠埃希菌8株,肺炎克雷伯菌有2株,阴沟肠杆菌1株,鼠伤寒沙门菌1株;在8株大肠埃希菌中,其中有3株为ST224型且分离自肝胆外科;2株为ST5706型,其余3株都不相同。12株CRE的blaNDM-5阳性质粒均可成功接合到大肠埃希菌C600;经质粒不相容群PCR检测,发现其中10株NDM-5阳性质粒为IncX3型;只有1株肺炎克雷伯菌和1株鼠伤寒沙门菌的质粒类型为IncF型。通过质粒MLST分型发现,这两株菌的质粒型别分别K9：A-：B-和S2：A-：B-,说明两种质粒并无同源性。通过对鼠伤寒沙门菌S81741的全基因组三代测序发现,S81741携带blaNDM-5的IncFⅡ型质粒pST41-NDM为84,565-bp,通过在NCBI上进行比对发现,它与2个携带blaNDM-5和1个携带blacTX-M-27的IncFⅡ型质粒相似度较高,这四个质粒的骨架区基本一致,但是在可变区内,有大量的IS26转座序列集中在这个区域,同时一些耐药基因也被整合在可变区内。然而,通过分析pST41-NDM的可变区发现,blaNDM-5的侧翼序列“IS3000-△ISAba125-IS5-blaNDM-5-ble-trpF-dsbC-IS26”与之前报道的IncX3质粒PNDM_MGR194携带的blaNDM-5的侧翼序列完全相同,并且其它11株NDM-5阳性的CRE菌株质粒上也存在相同的结构。 结论：造成NDM-5耐药基因在该院区肠杆菌科细菌中流行的原因主要以IncX3型质粒介导或IS26介导的水平转移进行传播。首次在广东地区报道了NDM-5在沙门菌中的出现,并发现其携带blaNDM-5的质粒为IncFⅡ型,该质粒有可能成为blaNDM-5在肠杆菌科细菌中传播的潜在因素。
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